糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)作为一种核受体,介导糖皮质激素的作用,调节机体一系列生理活动。GR广泛分布于机体组织细胞中,但其表达和功能具有组织特异性。GR基因由9个外显子(exon)构成,其中exon 1是非翻译性外显子。GR通过蛋白发挥生物学功能,GR蛋白表达与其mRNA水平密切相关,因此转录调控是GR组织特异性分布的一个重要调节机制,exon 1 mRNA变体的表达与GRmRNA水平密切相关,GR选择性启动子调控各自exon 1 mRNA变体的表达。本实验室之前确定了猪GR启动子区序列,发现其与人和大鼠具有极高的同源性,并鉴定出7种GR exon 1 mRNA变体。但目前猪GR基因及其exon 1 mRNA变体组织特性分布的研究甚少,其选择性启动子活性分析仍为空白,GR组织特异性抗炎功能以及GR在炎症状态下的转录调控机制也不清楚。本研究确定了总GRmRNA及各exon 1 mRNA变体的组织特异性分布模式；分析了GR选择性启动子活性的组织特异性；检测了L1-4和L1-10在不同类型细胞中对糖皮质激素的敏感性；检测了在LPS刺激下,猪肝脏、肌肉中GR组织特异性的表达及其功能；阐述了LPS处理下,GR的组织特异性转录调控的分子机制。1、猪GR基因组织特异性表达及其启动子活性分析在人上已经证明exon 1 mRNA变体的表达影响GRmRNA的组织特异性分布和功能。在猪上,GR功能具有组织特异性,但是目前对猪GR组织特异性分布的研究还很少。因此,本实验用绝对定量real-time PCR检测了大白断奶仔猪总GR mRNA及其exon 1 mRNA变体在海马、肝脏和肌肉三种组织中的分布。根据本实验室刚刚发表的GR 5’UTR序列,用PCR克隆待检测的GR exon 1 mRNA变体,将得到的PCR产物与pSPT18连接后得到重组质粒,单酶切质粒后得到绝对定量PCR中所需的标品,然后用real-time PCR检测总GR及exon 1-4、1-12、1-6、1-7和1-9/10变体mRNA的拷贝数。结果显示总GR mRNA拷贝数及绝大部分exon 1 mRNA变体的拷贝数均呈现组织特异性：在肝脏中表达水平最高,在海马中最低。为了确定GR选择性启动子活性的组织特异性,研究GR exon 1 mRNA变体组织特异性分布的机理,我们首先克隆了短型(S1-4、 S1-5、S1-6、S1-7、S1-10、S1-12)和长型GR启动子(L1-4、L1-5、L1-6、L1-7、L1-10)片段,并连入pGL3-basic质粒中构建启动子活性分析质粒,然后在HepG2、SY5Y、C2C12三种细胞中对这些启动子片段进行活性分析,并比较短型和长型启动子活性。结果表明长型启动子活性比短型启动子更符合在体exon 1 mRNA变体表达的情况,并表现出组织特异性。结果表明,猪GR exon 1 mRNA变体的表达存在组织特异性,并与总GR mRNA的组织特异性表达一致。GR exon 1 mRNA变体的组织特异性分布与GR长型选择性启动子的组织特异性活性有关。2、GR启动子对糖皮质激素的细胞特异性应答糖皮质激素的作用要通过GR介导,同时在糖皮质激素作用下,GR的mRNA表达水平也会受到GR的调控。在人和大鼠上已经证实,在糖皮质激素的刺激下,GR启动子活性发生变化,并存在组织或细胞特异性,但是糖皮质激素对猪GR启动子活性的影响的相关研究仍是空白。为了研究糖皮质激素刺激下猪GR基因的组织特异性转录调控的分子机制,选用HepG2(人肝癌细胞)、SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)、C2C12(小鼠成肌细胞)三种细胞,检测糖皮质激素处理对GR选择性启动子活性的影响。首先用地塞米松(DEX)刺激HepG2,分别对S1-4(含有1个nGRE)和S1-6(不含nGRE)两种短型选择性启动子进行活性分析。发现在DEX处理下,只有S1-4启动子活性发生上调,而S1-6没有变化。Western blot检测发现,DEX处理后,三种细胞中内源性GR蛋白水平均显著下调,此时内源性GR对自身启动子活性在生理状态下的抑制作用明显下降,因而表现出DEX作用下,含有nGRE的片段活性显著增强。在0.01μM、0.1μM、0.5μM、 1μM、10μM DEX处理下,用CCK-8试剂盒检测三种细胞的细胞活力,结果显示细胞活力没有变化。在0.01μM、0.1μM、0.5 μM、1μM、10μM DEX处理下,在三种细胞中,用双萤光素酶报告基因分析两种含有不同数目nGRE的长型GR启动子片段L1-4(1个)和L1-10(3个)的启动子活性,结果显示,在HepG2中L1-10对DEX的敏感性高于L1-4,nGRE的数目会影响启动子对糖皮质激素应答的敏感性,并且这种影响表现出细胞特异性。结果表明,在糖皮质激素刺激下,在HepG2、SY5Y、C2C12三种细胞中,GR选择性启动子上的nGRE使启动子活性上调。GR选择性启动子对糖皮质激素的应答敏感性与启动子上nGRE的数目有关,并表现出细胞特异性。3、LPS处理下GR组织特异性的表达及功能LPS会引起机体产生免疫应答和炎症反应,以清除侵入机体的病原体,然而过度的免疫反应会引起组织损伤。LPS可以引起HPA轴激活,使肾上腺生成并释放糖皮质激素,GR介导糖皮质激素发挥抑制炎症的作用。那么LPS处理下GR的组织特异性表达是否对炎性产生组织特异性影响呢?ELISA检测结果显示,LPS处理下炎性因子TNF-a和IL-6在肝脏中显著升高(P<0.05),而在肌肉中不变。为了探讨肝脏、肌肉中的炎性反应不同产生的原因,我们检测了肝脏、肌肉中的皮质醇含量,结果发现在LPS刺激下皮质醇水平在两种组织中都显著升高(P<0.05)。接着检测了肝脏和肌肉中GR的表达,用Western blot检测GR蛋白表达,用real-time PCR检测GR mRNA的表达,发现在LPS处理下肝脏中GR蛋白及mRNA水平显著下调,而在肌肉中不变。用ChIP检测GR与TLR4、TNF-α和IL-6启动子片段的结合水平发现,LPS处理下,在肌肉和肝脏中,GR与TLR4启动子上的结合不变,在肝脏中GR与TNF-α和IL-6启动子的结合水平降低,而在肌肉中不变。以上实验结果表明,LPS处理下肝脏中发生了明显的炎症反应,而在肌肉中没有。糖皮质激素水平的改变平并不是引起组织特异性炎症的原因,组织特异性抗炎功能是由炎症状态下GR的组织特异性表达造成的,肝脏中的GR表达水平下调使肝脏中发生了糖皮质激素抵抗,从而使肝脏中GR不能发挥抗炎作用。肝脏中GR蛋白和：mRNA的同向变化提示,GR转录调控在GR的表达中发挥重要作用。4、LPS处理下GR组织特异性转录调控机制为了探讨LPS处理下GR exon 1 mRNA变体表达的变化方式,我们用real-timePCR检测LPS处理下肝脏、肌肉中GR exon 1 mRNA变体的表达,结果发现,在肝脏中exon 1-4、1-5、1-6 mRNA表达都显著下降(P<0.05),其他exon 1 mRNA变体没有变化,而肌肉中exon 1-4、1-5、1-6三种变体的mRNA表达显著降低(P<0.05),exon 1-10显著升高。为了确定在LPS处理下转录因子对GR组织特异性转录调控的影响,我们用Western blot和ChIP,分别检测了能够与GR启动子结合的转录因子的蛋白表达水平以及转录因子和GR启动子的结合情况,结果显示LPS刺激下,p-CREB蛋白表达在肌肉中显著升高(P<0.05),在肝脏中不变；p-GR蛋白水平在肝脏中显著降低(P<0.05),在肌肉中不变。p-CREB在肝脏中与GR启动子片段1-4、1-5的结合显著降低(P<0.05),GR与启动子结合情况p-CREB相似。这些结果表明,p-CREB作为p38MAPK信号通路激活的转录因子,在肌肉中被特异性激活,结合在GR上启动子,保证肌肉中GR的正常转录。为了确定LPS处理下组蛋白乙酰化对GR组织特异性转录调控的影响,我们检测了肌肉中总的组蛋白H3的乙酰化水平以及GR启动子上的组蛋白H3的乙酰化水平。Western blot结果显示,肝脏和肌肉中乙酰化组蛋白H3的表达在LPS的作用下显著降低,但ChIP的结果显示肝脏中GR启动子1-4、1-5上乙酰化水平显著降低(P<0.05),而在肌肉中仅1-5的乙酰化水平降低(P<0.05),说明组蛋白H3的乙酰化水平影响了GR的组织特异性转录调控。用Western blot对肝脏、肌肉中的免疫反应及致炎信号通路中的关键因子p65NF-κB及p38 MAPK的蛋白表达进行分析,结果显示磷酸化的p65 NF-κB表达水平在肝脏中显著升高(P<0.01),在肌肉中不变,磷酸化的P38MAPK表达水平在肌肉中显著升高(P<0.01),在肝脏中不变。结果表明LPS处理下肝脏、肌肉中激活的免疫反应信号通路存在组织特异性。以上实验证明GR在肝脏、肌肉两种组织中转录调控的组织特异性与炎性反应信号通路有关。