急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是指患者突然发生大量肝细胞坏死,或出现严重的肝功能损害,并于起病8-24周内,出现肝昏迷的一种临床综合征。传统的内科治疗并不能逆转肝衰竭患者的预后,肝移植术是目前唯一有效的治疗方式。但由于供体来源短缺、实施肝移植治疗等待时间过长、手术费用昂贵、术后需终生服用免疫抑制剂等缺陷限制了其应用。近些年来,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)已被证实具有免疫抑制和修复损伤组织的能力。并且大量的基于干细胞移植治疗的研究已在医学领域取得了令人瞩目的成果,为多种疾病的治疗提供了新的思路。MSC移植也已被用于治疗包括急性肝衰竭在内的各种终末期肝病的实验及临床研究。但同时国内外的许多研究也发现了细胞移植疗效不佳的现象,对这一系列文献的回顾性研究发现主要有两个原因制约了 MSC移植治疗的疗效,一是由于移植的MSC在肝脏的定植率较低,二是由于肝功能衰竭体内存在过激的炎症反应,这在一定程度上抵消了 MSC的组织修复能力。同时,干细胞移植治疗急性肝衰竭的机理尚缺乏统一认识。因此,本课题从提高移植干细胞在肝脏的定植率和降低急性肝衰竭体内过激的炎症反应入手,通过明确干细胞移植治疗的机制,解决目前干细胞移植治疗急性肝衰竭效率低下的问题。第一部分:CXCR4促进骨髓间充质干细胞在肝脏定植的相关研究目的:提高外周静脉注射的CXCR4-MSC在急性肝衰竭裸鼠肝脏的定植率和疗效。方法:构建CXCR4慢病毒载体并进行包装和滴度测定,采用慢病毒侵染骨髓间充质干细胞构建过表达CXCR4基因的稳定转染细胞株。qPCR检测CXCR4基因转录水平的表达,Western Blot和流式细胞术检测CXCR4蛋白水平的表达。20%v/v四氯化碳(CC14)橄榄油溶液8μl/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型,ELISA实验检测急性肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平。迁移实验检测转染的骨髓间充质干细胞向基质衍生因子-1α(SDF-1α)的趋化能力。模型诱导后24小时裸鼠尾静脉分别注射CXCR4转染的间充质干细胞(CXCR4-MSC,n=10)和未转染的间充质干细胞(Null-MSC,n=10),并采用ALF组作为对照(n=10)。于注射后各时间点活体示踪MSC分布情况,评估CXCR4对MSC肝脏靶向定植的作用。结果:qPCR、WB和流式细胞术检测显示构建的CXCR4-MSC高表达CXCR4基因和CXCR4蛋白;急性肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平明显升高,与正常裸鼠相比有统计学差异。体外迁移实验证实CXCR4-MSC比Null-MSC具有向SDF-1α更好的迁移能力。体内活体成像显示干细胞移植后第1天和第5天,CXCR4-MSC主要定植在肝脏,而Null-MSC在肝脏和脾脏都有定植。结论:通过基因修饰使MSC高表达CXCR4基因能够促进MSC在急性肝衰竭肝脏的定植,为MSC移植治疗急性肝衰竭提供了广阔的前景。第二部分:IL-1β siRNA腺病毒载体抑制肝脏IL-1β的相关研究目的:构建IL-1β siRNA腺病毒载体,筛选出其抑制裸鼠肝脏内IL-1β水平的最佳剂量和最佳时间点,并验证腺病毒载体的免疫源性。方法:针对IL-1β设计并合成一套siRNA干扰序列,共4对;将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中。将一系列化学合成的oligo通过PCR的方法拼接成所需的序列,并将合成好的序列TA克隆入pMD-18T载体,测序验证。然后再将目的基因克隆装入载体pcDNA3.1+;测序验证,构建高表达载体。将干扰载体和高表达载体同时转染模型细胞HEK293细胞进行干扰效果评价,挑选干扰效果最好的干扰载体通过重组转换成腺病毒载体;并利用293A细胞进行腺病毒的包装,收集病毒原液并测定病毒滴度。裸鼠(n=20)尾静脉分别注射腺病毒 2×107 ifu(20μl)、5×107 ifu(50μl)、1×108 ifu(100μl)和2×108ifu(200μl)。并设置正常组(n=5)作为对照,36h后取肝脏qPCR检测肝组织IL-1β相对表达量,筛选最佳计量。随后使用最佳计量尾静脉注射,注射后不同时间点取裸鼠肝脏,qPCR检测IL-1β相对表达量,评估IL-1β siRNA腺病毒载体对IL-1β的最佳干扰时间点。选取健康裸鼠尾静脉注射最佳计量不含IL-1β siRNA的腺病毒空载体,4h后ELISA检测血清INF-γ、TNF-α和IL-6水平,评估腺病毒载体的免疫源性。结果:成功构建四对IL-1β siRNA腺病毒载体,qPCR显示干扰载体13MR0069-4的基因沉默效果最佳,达到69%。qPCR实验显示注射剂量为1×108 ifu时干扰效率达到90%左右,继续增加病毒数量干扰效率无明显变化。在注射IL-1β siRNA腺病毒载体后36h,干扰效率最高,达到76%,随后干扰效率逐渐降低,到第5天时降为40%。尾静脉注射1×108 ifu腺病毒空载体4h后,血清中INF-y、TNF-α和IL-6水平无明显升高。结论:IL-1β siRNA腺病毒载体具有强烈的IL-1β抑制效应,1×108 ifu为最佳干扰剂量,注射36h后干扰效率最高。该载体不诱导非特异性免疫反应,可以用作下一步研究。第三部分:IL-1β siRNA联合CXCR4-MSC治疗急性肝衰竭的相关研究目的:评估第一部分构建的CXCR4-MSC与第二部分构建的IL-1β siRNA腺病毒载体联合治疗急性肝衰竭的协同作用。方法:20%v/v四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液8μ1/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型。100只裸鼠随机分为5组:正常对照组(n=20);ALF组(n=20);IL-1β siRNA组(n=20),裸鼠造模前6小时尾静脉注射腺病毒1×108 ifu;CXCR4-MSC组(n=20),裸鼠造模后24小时后尾静脉注射CXCR4-MSC约5×105;IL-1β siRNA+CXCR4-MSC组(n=20),裸鼠造模前6小时尾静脉注射腺病毒1×108 ifu,造模后24小时后尾静脉注射CXCR4-MSC约5×105。每组随机抽取10只裸鼠用于生存期观察,其余裸鼠于注射后各时间点检测各组裸鼠肝功能、生存率、血清炎症因子水平、组织病理学改变、肝细胞凋亡和肝细胞增殖情况。为评估IL-1β siRNA对MSC的保护作用,免疫组化和荧光显微镜观察肝脏组织切片中的GFP 阳性细胞。检测肝脏中VEGF和HGF含量,初步探讨联合治疗的机制。结果:IL-1β siRNA+CXCR4-MSC具有促进肝功能恢复、显著降低转氨酶及体内促炎因子水平、促进肝细胞增殖、降低肝细胞凋亡的功能,效果优于单独应用IL-1β siRNA或者CXCR4-MSC;免疫组化及荧光显微镜显示IL-1βsiRNA+CXCR4-MSC组比CXCR4-MSC存活数量明显增多;ELISA显示IL-1βsiRNA+CXCR4-MSC组分泌VEGF和HGF较其余各组明显增多。结论:IL-1β siRNA能够发挥对移植CXCR4-MSC的保护作用,两者联合使用具有协同作用。