L-草铵膦（L-phosphinothricin）是一种杀草活性高、环境友好且市场前景广阔的绿色仿生除草剂。利用谷氨酸脱氢酶催化2-羰基-4-（羟基甲基膦酰基）丁酸（PPO）不对称还原胺化合成L-草铵膦是一条具有非常大工业应用潜力的工艺路线。本文围绕着该工艺路线的开发展开研究,主要内容如下:一、筛选获得对目标底物PPO具有还原胺化活力的酶催化剂是本项工作开展的前提。基于基因组探矿技术,构建了一个包含34个氨基酸脱氢酶的酶库,并从中筛选获得一个对PPO催化活力较高且可溶性表达良好的谷氨酸脱氢酶-PpGluDH。PpGluDH 来源于 为 NADP+依赖型,单位发酵液酶活达110.1 U/L,纯化后酶蛋白的比酶活为0.296 U/mg,显著高于文献报道水平。二、为提高PpGluDH对PPO的催化活力,对其进行理性设计改造。首先通过多序列比对挖掘氨基酸脱氢酶酶库所包含的序列-功能关系信息,用于指导PpGluDH的活力改造,成功获得一个酶活提高2.1倍的突变体-I170M。随后,基于同源建模与分子对接模拟分析,对PpGluDH活性口袋中的一个“锚穴”结构进行扩大,使其能够容纳PPO较大的γ位基团。成功筛选获得两个对PPO催化活力显著提高的突变体-A167G与V378A,它们对PPO的比酶活分别提高了 129倍与121倍。拓展研究表明,“锚穴”结构扩大同样可以提高谷氨酸脱氢酶家族其它成员对PPO的催化活力。其中,酶活提高倍数最大达1820倍,纯蛋白比酶活最高达111.02 U/mg。同时,“锚穴”改造还使NAD+依赖型的谷氨酸脱氢酶对PPO的催化活力从无法检出的水平提高至相对较高的水平（1.90-29.48 U/mg-蛋白）。三、基于定向进化结果,创造性地以半理性设计对PpGluDH的“铰链”区域进行改造。构建了 5个饱和突变库,并从其中的4个中筛选获得了对PPO催化活力显著提高的阳性突变体,证明“铰链”区域是对酶活影响较大的敏感区域。最优“铰链”改造突变体单位发酵液酶活达11.21 U/mL,纯蛋白比酶活达30.67 U/mg,是野生型比酶活的104倍。通过分子动力学模拟对“铰链”改造突变体的酶活提高机制进行了解析,并测定了这些突变体的底物特异性。最后评价了“铰链”改造突变体在三个高价值L-氨基酸制备中的效率。四、采用两种策略实现“锚穴”改造与“铰链”改造的组合,以进一步提高PpGluDH对PPO的催化活力,开发具有实际应用价值的高活力菌株。通过组合,获得的活力最佳突变体A167G/A379S/L383Y（PpGluDH-3M）对PPO的单位发酵液活力提高至73.37U/mL,纯蛋白比酶活提高至206.09U/mg,是野生型的696倍。测定了 PpGluDH-3M的酶学性质,为该酶的后续研究与应用提供基础数据。五、基于文献调研与酶活测定,选择来源于Bacillus subtilis并已进行热稳定性改造（Q252L/E170R）的葡萄糖脱氢酶BsGDH-2M用以构建辅酶再生系统。采取三种不同的单质粒共表达策略将PpGluDH-3M与BsGDH-2M在E.coli BL21（DE3）内进行共表达。总共构建了 9个单质粒共表达菌株,它们都成功实现了双酶的共表达。这些共表达菌株之间表现出不同的酶活与蛋白表达水平。测定了不同共表达菌株催化转化0.25 M PPO的反应进程。其中,共表达菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-GluDH-GDH表现出最高的催化效率,能够在1 h内将0.25 MPPO转化99%以上,时空产率达1021 g.L-1.d-1。六、对共表达菌株全细胞催化工艺参数进行了优化。通过优化,反应体系中不需额外添加硫酸铵,葡萄糖与PPO的摩尔比由1.2:1降低至1:1,辅酶NADP+添加量降至原来的10%,TTN值提高10倍,辅酶成本大幅降低,时空产率提高2.2倍,生产效率显著提高。随后,基于已优化的反应参数,建立了底物流加补料催化工艺,较好地解决了高浓度PPO不稳定的问题,成功提高了反应体系的底物浓度与最终产物积累浓度,表现出非常大的工业应用潜力。