论文部分内容阅读
鼠多瘤病毒（murine polyomavirus，MPV）的病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）是由衣壳蛋白VP1自组装形成的不包含遗传物质的空心纳米颗粒，在疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物纳米材料等方面具有重要的研究价值。MPVVLP中五个VP1聚集形成五聚体衣壳粒（capsomere，Cap），72个衣壳粒自组装成MPV VLP。目前VP1生产中其分离纯化阶段需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶（GST）亲和标签，导致较高的生产成本和复杂的操作过程，限制其大规模生产应用。因此，本文致力于开发经济且便捷的新型制备方法，从以下两方面开展研究。其一，开发内含肽（intein）介导的VP1生产纯化流程。首先通过PCR扩增出Ssp DnB intein基因片段，插入质粒的GST-tag和VP1之间，构建重组质粒pGEX-4T-1-intein-VP1，并导入E.coli中表达融合蛋白GST-intein-VP1。然后利用GST亲和色谱纯化融合蛋白。其后，改变色谱柱内pH值和温度获得适于内含肽剪切的条件，诱导内含肽柱内自剪切（pH7.0和25℃，切割36h），使VP1与GST-intein分离，得到纯化的VP1。此流程所得VP1产量为4mg/(L培养基)，且通过两步透析法自组装证实其具有天然结构。其二，考察Cap的新型亲和肽配基N-DWDLRLLYC的分离纯化效能。利用实验室前期通过仿生设计筛选获得的高亲和性肽配基N-DWDLRLLYC，通过偶联到Thiopropyl Sepharose6B介质制备出多肽亲和介质。静态吸附和色谱实验表明，该亲和介质对Cap具有特异性亲和作用，基因工程重组菌表达的培养液通过进一步分离纯化后VP1的纯度由15.6%提高到70.1%，收率为47±3%。因此，本文研究成果有望简化MPV VLP的生产纯化流程并大幅降低成本，为其高效制备和应用奠定基础。