论文部分内容阅读
背景: 牙周炎是世界上最广泛流行的感染性疾病之一,是成年人牙齿缺失的主要原因,严重威胁着人类的身心健康.牙周炎的治疗,目前常用方法有洁治术、刮治术、根面平整术等,但却很难修复受损的牙周组织.自牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)发现以来,国内外很多研究证实了其重要的骨向分化能力,干细胞移植治疗目前已成为促进牙周组织再生的研究热点之一.肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是牙周炎骨丧失过程中重要的炎性因子,参与并启动炎症反应,这些炎性因子干扰了细胞赖以生存的微环境,影响细胞的代谢和功能,干细胞的骨向分化能力很可能受其所在的炎症微环境影响. 近年来长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)成为研究的热点,它是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,虽不直接参与蛋白质的编码,但可通过表观遗传、转录、转录后等途径调控靶基因的表达.已有研究分析骨髓间充质干细胞、PDLSCs骨向分化中LncRNA的表达特征,证实LncRNA与干细胞的分化有着密切联系.而在TNF-α作用下PDLSCs骨向分化中LncRNA的表达情况,目前还未见报道,这亟待我们的研究. 目的: 探讨TNF-α对PDLSCs骨向分化能力的影响,并分析在此过程中LncRNA的表达情况及其可能发挥的功能. 方法: 1.体外分离、培养和鉴定PDLSCsPDLSCs通过酶消化联合组织块法的原代培养,免疫磁珠筛选、免疫荧光鉴定. 2.TNF-α对PDLSCs骨向分化作用的测定PDLSCs的骨向诱导及实验分组:对照组(成骨诱导液培养的PDLSCs),实验组(成骨诱导液+10ng/mL TNF-α培养的PDLSCs).两组PDLSCs的茜素红染色及定量,RT-PCR和Western bolt检测成骨标志物的表达. 3.高通量测序及LncRNA的表达分析提取两组细胞总RNA,质检合格后样本送检.利用Illumina PE150进行转录组范围内第二代高通量测序,生物信息学分析LncRNA的表达情况. 结果: 1.酶消化联合组织块法是培养PDLSCs快捷、有效的方法,经过免疫磁珠筛选分离、免疫荧光的鉴定,可以证明牙周膜中存在着具有干细胞特性的PDLSCs. 2.与对照组相比,实验组生成的结节面积更小、颜色更浅,在后续RT-PCR和Western blot实验中,实验组相关成骨标志物的表达均明显低于对照组,说明TNF-α抑制PDLSCs的骨向分化能力. 3.通过高通量测序,我们鉴定出差异表达显著的318个LncRNA,其中149个上调,169个下调.经生物信息学分析,得到差异基因的功能富集情况.并通过RT-PCR技术,验证了4个LncRNA的表达水平. 结论: 在10ng/mL TNF-α刺激下,PDLSCs的骨向分化能力减弱.本研究发掘了PDLSCs中LncRNA表达谱的有价值的资源,尤其强调了LncRNA在TNF-α调控PDLSCs骨向分化过程中的重要性,为牙周再生和口腔组织工程提供理论依据.