马立克氏病（Marek’s disease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s diseasevirus，MDV）感染鸡而引发的一种高传染性、免疫抑制性和肿瘤性疾病。虽然MD肿瘤的发生可以用疫苗来进行免疫预防，但由于MDV毒力的不断增强，近年来在疫苗免疫鸡群中仍不断有MD的发生，给养鸡业造成了严重的经济损失。MicroRNA(miRNA)在多种生物学过程中发挥重要的转录后基因调控功能，研究发现MDV也编码数十种miRNA基因，它们在病毒的复制、潜伏感染、诱导肿瘤发生等方面可能具有重要的调控作用。MDV-1编码的14个miRNA基因全部位于病毒基因组的反转重复序列区中，且形成3个miRNA基因簇，其中Meq基因簇miRNAs可能在MDV致病和致瘤中发挥关键作用。为了进一步探究MDV致病和致瘤的分子机制，本研究在vv MDV GX0101BAC克隆的基础上，采用RecE/T重组技术构建MDV-1Meq基因簇miRNAs及Meq基因簇内各miRNA单基因缺失的MDV毒株，经动物实验研究该基因簇内miRNAs基因缺失对MDV-1致病表型的影响，最终探明具有调控MDV-1致病表型作用的miRNA，为进一步阐明其分子调控机制奠定基础。首先，在超强毒MDV分离株GX0101BAC克隆的基础上，分别采用2轮RecE/T重组突变对MDV meq基因簇内miR-M9、miR-M5、miR-M12、miR-M3、miR-M2、miR-M4及整个Meq基因簇miRNAs分别进行缺失，并对各缺失后的BAC克隆进行多基因的PCR鉴定及DNA序列分析。结果表明，经过2轮RecE/T重组突变，成功获得了缺失整个Meq基因簇miRNAs和Meq基因簇内各miRNA单基因的BAC克隆，分别命名为GX0101ΔmiR-M2-BAC、GX0101ΔmiR-M3-BAC、 GX0101ΔmiR-M4-BAC、 GX0101ΔmiR-M5-BAC、GX0101ΔmiR-M9-BAC、GX0101ΔmiR-M12-BAC和GX0101△Meq-miRs-BAC。其次，将GX0101ΔmiR-M2、 GX0101ΔmiR-M3、 GX0101ΔmiR-M4、GX0101ΔmiR-M5、GX0101ΔmiR-M9、GX0101ΔmiR-M12和GX0101ΔMeq-miRs的BAC DNA分别转染单层CEF进行病毒的拯救，并对拯救的病毒进行鉴定。结果表明，成功获得了MDV miRNA基因缺失株GX0101ΔmiR-M2、GX0101ΔmiR-M3、GX0101ΔmiR-M4、GX0101ΔmiR-M5、GX0101ΔmiR-M9、GX0101ΔmiR-M12和GX0101ΔMeq-miRs。采用SYBR Green I qRT-PCR对感染CEF后不同时间各GX0101△miRNA毒株的Meq基因及gB基因进行定量，检测各GX0101ΔmiRNA毒株在CEF上的复制动力学。结果在感染CEF后0-144h内各MDV GX0101ΔmiRNA毒株均显示与亲本株GX0101BAC相似的增殖曲线，表明Meq基因簇内各miRNA不是MDV复制的必需基因。最后，将MDV GX0101ΔmiR-M2、GX0101ΔmiR-M3、GX0101ΔmiR-M4、GX0101ΔmiR-M5、GX0101ΔmiR-M9、GX0101ΔmiR-M12和GX0101ΔMeq-miRs毒株分别感染1日龄SPF白来航鸡，进行各病毒株致死率、致肿瘤率、在攻毒鸡体内复制力、鸡生长性能和免疫器官发育及显微肿瘤发生情况等方面的检测、分析。结果表明，亲本株GX0101BAC在75dpi时的致死率已为100%，而各GX0101ΔmiRNA毒株在90dpi的累计致死率均仍低于亲本株GX0101BAC，且GX0101△miR-M5的致死率最高，其次分别为GX0101△miR-M3、GX0101△miR-M9、GX0101△miR-M2、GX0101△miR-M4、GX0101△miR-M12和GX0101△Meq-miRs；在75dpi时，而各GX0101ΔmiRNA毒株累计肉眼肿瘤发生率均低于GX010BAC，在90dpi时GX0101Meq-miRs的累计肿瘤发生率最低，其次分别为GX0101△miR-M12、 GX0101△miR-M3、 GX0101△miR-M4、GX0101△miR-M5、GX0101△miR-M2、GX0101△miR-M9；Meq基因簇内miRNAs并不是MDV的体内复制所必需，但Meq基因簇内miRNAs的缺失影响病毒的体内复制。除GX0101△miR-M3在30dpi时、GX0101△miR-M5在21dpi-30dpi时抑制感染鸡的生长外， GX0101△miR-M2、 GX0101△miR-M4、GX0101△miR-M9、GX0101△miR-M12及GX0101△Meq-miRs对感染鸡的体重增长没有影响；各miRNA缺失株在14-21dpi期间的法氏囊指数与胸腺指数均显著低于CEF对照组，但各miRNA缺失株和GX0101BAC毒株之间没有持续性的显著差异。各GX0101ΔmiRNA感染鸡后肝脏显微肿瘤发生率也低于亲本株GX0101BAC，且GX0101Meq-miRs组的肿瘤形成率最低，其次分别为GX0101ΔmiR-M12、GX0101ΔmiR-M2、GX0101ΔmiR-M4、GX0101ΔmiR-M3、GX0101ΔmiR-M9、GX0101ΔmiR-M5。综上所述，Meq基因簇内miRNAs的缺失虽不能完全废除MDV的致瘤性，但却能阻止肿瘤的发生进程，Meq基因簇miRNAs对MDV的致病表型具有重要的调控作用，但Meq基因簇内的各miRNA在MDV致瘤过程中可能具有不同的调控作用，其中MDV1-miR-M12的潜在调控作用可能最为重要，其次为MDV1-miR-M2、 MDV1-miR-M3、 MDV1-miR-M4和MDV1-miR-M9，而MDV1-miR-M5的调控作用可能最弱。本研究的结果将为进一步研究Meq基因簇miRNAs调控MD致病及致瘤的的分子机制奠定了重要基础。