研究背景毒品滥用是当今各国都面临的社会问题。由于依赖性精神药物的直接药理学作用靶器官是中枢神经系统,因此其对中枢神经系统损伤的研究一直倍受关注。METH有很强的精神刺激性和依赖性,且其被滥用的趋势近来逐年上升。目前的研究表明,METH的神经毒性作用与某些活性物质的产生密切相关,如活性氧、一氧化氮及其次级产物ONOO-等。由这些活性物质所诱发的一系列神经毒性事件,是导致损伤敏感脑区（单胺类神经末梢）发生不可逆性实质损伤的主要因素,而MG诱发的炎性反应在其中发挥了十分重要的作用。炎症是机体一种防御性的反应,但如不能有效地加以控制,则导致组织损伤。有研究表明,MG参与了中枢神经系统内多种病理（如神经毒性剂的毒性损伤、帕金森病等神经慢性疾病、局部缺血甚至脑外伤）条件下的慢性炎症反应,并加重了组织细胞的损伤。同样METH作用后,受损的敏感脑区内出现了MG的激活,表明MG参与了损伤的过程。MG作为中枢神经系统内固有的唯一免疫细胞类型,与上述神经炎性损伤过程密不可分。但由于中枢神经系统的复杂性,毒性剂量METH所引发的MG激活及其诱发的炎性损伤反应的研究还存在很多疑问:如METH与MG的激活之间有什么直接关系?在MG激活的时程中,受损敏感脑区发生的哪些变化与其激活有关?受损脑区内是否存在某些因素对MG激活及其后续炎性反应具有调节作用?对于上述问题,至今未有十分明确的结论,更缺乏系统性的研究。本研究内容系在本室近几年来研究METH中枢毒性损伤机制的基础上,通过体内和体外不同实验体系,对MG的激活及其所继发的炎症病理损伤过程作为研究主线,为阐明这一炎症反应损伤发生的确切机制提供实验证据。研究目的中枢神经系统内,由于METH的神经毒性对单胺能神经末梢具有选择性,因此我们选择纹状体为研究对象。研究纹状体内MG激活的时程变化、形态学变化、表型变化,及其激活时程内的病理损伤事件;模拟METH毒性作用初期微环境的变化（氧化应激）,在体外条件下研究MG内相关的炎症反应细胞信号调节通路蛋白表达的变化等。通过上述研究,来初步明确MG激活及诱发的炎症反应在METH神经毒性损伤中的作用。研究方法1.MG参与METH大鼠脑纹状体炎性损伤的研究1.1实验模型的复制及纹状体内MG激活特性的研究动物模型为成年雄性Wistar大鼠（体重200±20g,n=48）,平均分为实验组（腹腔注射METH,15mg/Kg,共8次,每次间隔12h）和对照组（给药方式相同,每次注射1ml生理盐水）,分别于首次注射后第0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d进行取材及各项检测。研究内容主要包括CD-11b抗体免疫组化法检测MG激活比率及时程变化,透射电镜观察其激活后的超微结构改变和流式细胞仪检测CD-11b和MHC-Ⅱ双阳性细胞率的变化,进一步明确MG的激活。1.2纹状体内导致MG激活的诱因及调控因素在前期明确MG的激活水平及时程变化的基础上,进一步研究导致其激活的主要因素及相关的调控因素。内容主要包括:高效液相色谱法检测纹状体内多巴胺含量、ROS试剂盒检测纹状体内活性氧含量和Western blotting法检测CD-200蛋白表达量的变化。1.3纹状体内MG参与的炎性反应损伤及途径本部分主要对MG炎性损伤反应方式,以及纹状体的损伤程度进行研究。具体包括:ELISA法检测促炎细胞因子TNF-α和IL-1β含量的变化、免疫组化和Western blotting法检测TH表达量的变化以及透射电镜观察纹状体内神经纤维及末梢的超微结构改变。2.体外氧化应激条件下MG的激活及CD200分子对其激活和炎性反应的调控作用2.1新生Wistar大鼠原代MG培养体系的建立和皮质神经元的分离通过同系新生大鼠脑皮质原代MG的分离纯化培养和皮质神经元的分离,以及氧化应激条件MG激活模型的建立,来研究氧化应激条件下CD200参与调控MG激活及调控方式的初步研究。主要研究内容包括:采用利多卡因（12mmol/L）处理及差速贴壁的方法获得纯化的原代MG,并通过测定生长曲线来评价原代MG培养体系的稳定性;采用形态学观察及免疫荧光标记CD-11b和MHC-Ⅱ抗体的方法对分离得到的MG进行纯度和活化状态的鉴定;采用梯度微孔过滤和高糖培养基保护的方法,进行皮质神经元分离,并进行CD200分子表达率鉴定,为研究CD200分子对MG激活及激活后炎性反应的调节作用建立实验基础。2.2体外氧化应激条件下MG激活模型的建立及CD200参与的调控作用以LPS（0.5mg/L）为阳性对照,分别采用H₂O₂（100μmol/L）和METH（200μmol/L）为处理因素,并检测MG的激活特性。以此作为基础,来研究分离得到的神经元（CD200）对氧化应激条件下MG的激活及炎性反信号通路的调节作用。主要研究内容包括:氧化应激条件下,通过Western blotting法及免疫荧光标记法检测p-p38 MAPK的表达量及胞内表达定位、Western bloting法检测IκB-α蛋白表达量、ELISA法检测各组培养液中TNF-α和IL-1β的含量的变化,来明确急性分离的神经元参与调控MG激活及其调控方式。实验结果1.MG参与METH中毒动物模型大鼠脑纹状体炎性损伤的研究1.1动物模型的复制及纹状体内MG激活特性的研究毒性剂量METH作用下,实验大鼠出现了典型的刺激症状,表明成功复制出METH中毒动物模型。“实验组”纹状体内MG形态学变化:胞体变大,细胞突起变短,形态丰满,呈“灌木丛样”;另有部分MG,胞体变大、突起消失,呈“阿米巴样”;透射电镜下见激活的MG胞体明显变大,胞核电子密度降低,胞突变短增粗,胞质内细胞器丰富,并可见较多的溶酶体,另见其与神经元或轴突之间具有亲密的比邻关系。MG的激活率及时程:与对照组相比,实验组自首次注射后第1d-5d具有上升趋势,且第1d-7d均显著升高（n=9,P＜0.001）。激活MG的表型变化:CD-11b和MHC-Ⅱ双阳性细胞率逐渐升高。1.2纹状体内诱发MG的激活及调控机制METH作用后,与“对照组”相比:“实验组”多巴胺含量降低,且两组之间有显著性差异（n=3,P＜0.05）;“实验组”活性氧含量出现显著性升高（n=3,P＜0.05）;“实验组”CD200蛋白表达量有降低的趋势。1.3纹状体内MG参与的炎性反应损伤及损伤途径METH作用后,纹状体内TNF-α和IL-1β的含量出现显著性升高（n=3,P＜0.05）,“实验组”TH阳性免疫组化反应强度和蛋白表达量均出现降低,以及纹状体内神经纤维和末梢出现水肿、微丝溶解以及线粒体空泡化。2.体外氧化应激条件下MG的激活及CD200分子对其激活和炎性反应的调控作用2.1新生Wistar大鼠原代MG培养体系的建立和皮质神经元的分离分离得到了原代MG,其存活率≥95%,透射电镜下见纯化后的MG结构完好,CD-11b抗体检测阳性细胞率为97.0%,MHC-Ⅱ抗体阳性细胞率为2.47%;分离后皮质得到的神经元经流式细胞仪检测表达CD200的阳性细胞率约为87%。2.2氧化应激条件下体外MG激活模型的建立及CD200参与调控作用应用生理盐水、LPS、METH和H₂O₂分别处理原代培养的MG,结果LPS和H₂O₂均导致MHC-Ⅱ分子表达的阳性率升高、培养液内TNF-α和IL-1β的含量升高,而生理盐水和METH则无此作用。比较H₂O₂和H₂O₂+CD200对培养的MG激活及后续炎性反应的作用,结果显示H₂O₂+CD200处理后MG表达MHC-Ⅱ的阳性率低于单纯H₂O₂的处理。应用生理盐水、LPS、METH和H₂O₂分别处理原代培养的MG,结果LPS和H₂O₂均导致表达MHC-Ⅱ分子的阳性率升高、培养液内TNF-α和IL-1β的含量升高,而生理盐水和METH则无此作用。与单纯采用H₂O₂对MG的激活及炎性反应作用相比,H₂O₂+CD200处理后MG表达MHC-Ⅱ的阳性率、p-p38 MAPK的蛋白表达量和TNF-α及IL-1β的含量均降低,而IκB-α蛋白表达量升高。研究结论1.实验动物经METH刺激后,纹状体内MG被迅速激活;激活的MG功能开始活跃,并发挥炎性反应;同时MG具有了介导相应类型的淋巴细胞参与免疫反应的能力,并通过该途径强化了炎症反应的发生。2.METH的刺激作用,导致了纹状体内的DA大量释放并降解,同时产生ROS,并诱发了MG激活:而MG激活后,又进一步导致了纹状体内ROS含量的持续升高,表明MG通过释放ROS的方式参与了毒性损伤过程;纹状体内CD200表达量的降低参与了调控MG的激活。3.毒性剂量METH的连续刺激导致了纹状体内TNF-α和IL-1β含量升高,表明MG激活后通过释放细胞因子的这一途径参与了纹状体内神经组织的损伤。TH蛋白表达量出现了明显降低以及神经纤维及末梢的形态学异常,说明上述因素导致纹状体发生实质性损伤;尽管TH作为DA合成的第一限速酶,METH作用初期DA含量的降低并非是因为TH蛋白表达量降低所致。MG诱发的炎性反应与METH刺激后纹状体损伤密切相关。4.成功地建立同系新生大鼠原代MG的培养体系,为开展下一步体外实验研究奠定基础;急性分离获得的皮质神经元可用来进一步研究其对MG激活的调控作用。5.体外条件下,氧化应激条件导致了MG的激活,而METH对MG并不具有激活作用;激活MG表达MHC-Ⅱ的阳性细胞率升高以及培养介质内TNF-α和IL-1β的含量增加,这些结果进一步肯定了体内ROS含量的升高导致MG激活的结论;CD200分子可通过抑制p38 MAPK的磷酸化,进而下调NF-κB的活化,起到抑制MG激活及炎性反应的作用;结合体内实验结果,METH导致纹状体内CD200表达量的下调,则进一步强化了MG介导的炎性反应损伤。