研究背景及目的:肝纤维化是由致病因子引起的肝脏内结缔组织异常增生,肝内细胞外基质弥漫性沉积过度的病理过程。肝纤维化的形成是由于机体感染病毒时,引起肝脏炎症反应的同时,激活了肝脏的免疫系统修复组织,修复的过程过度或者失控时,导致肝功能异常和肝脏结构的改变。轻者为肝纤维化,严重者造成肝小叶的结构发生紊乱,逐步形成假小叶,最终演变为肝硬化。大量的临床研究结果表明[1],人体自身内部存在纤维降解系统,该系统可以使肝纤维化实现逆转,甚至早期的肝硬化也可能发生逆转[2][3],而肝组织损坏严重的失代偿期肝硬化则不能逆转。因此,早期诊断和治疗肝纤维化,就可以阻止肝纤维化向肝硬化的方向进展,这对于改善慢性肝病患者的预后有着极其重要的意义。早期的肝纤维化的血清标志物主要反映肝脏胶原的合成和分解代谢的动态变化,不能真正反映胶原蛋白的沉积程度。目前公认的肝纤维化诊断“金标准”是肝脏穿刺病理学检查。由于该检查具有创伤性及局限性,并且患者要忍受一定的痛苦,重复检查的可能性较小,因此其临床应用受到限制。影像学检查对重度肝纤维化诊断比较可靠,而对轻、中度肝纤维化的诊断则缺乏特异性。目前临床缺乏评价肝纤维化程度[4]的实用的血清标志物,所以,找出早期诊断肝纤维化、评价肝纤维化程度的血清标志物来指导临床的诊治是当前医学的一项重要研究课题。代谢组学(metabonomics/metabolomics)是主要研究生物被扰动后所产生代谢产物的种类、数量以及其中变化规律的一门科学。代谢组学已被应用到肝衰竭[5]、非酒精性脂肪肝[6]、原发性肝癌[7][8]、药物和毒物等非病毒性因素引起的肝脏损伤[9][10]等的早期标志物标志物筛查中,为疾病的早期诊断和治疗提供了新的方法。本实验采用高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质(uplc/ltq-orbitrapms)技术来分离并提取慢性乙型肝炎、代偿期肝硬化以及失代偿期肝硬化患者血清中的代谢产物,以期发现肝纤维化的代谢产物标志物群。方法:1.随机选取2011年10月-2013年9月于烟台市传染病医院就诊的慢性乙型肝炎患者34例,所有患者均接受了肝穿刺病理检查,随机选取于大连市第六人民医院住院治疗的失代偿期肝硬化患者15例。同期选择20例健康志愿者作为正常对照组,肝功正常、病原学检查阴性。所有入组人员在知情同意的前提下,留取空腹血4ml,半小时内将血清分离,留取血清,-80℃冰箱冷冻保存备检。2.高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(uplc/ltq-orbitrapms)技术检测所有患者血清中的代谢产物。2.1样品准备:室温下静置解冻血清,取100ul血清加400ul甲醇除蛋白,涡旋60秒,13000rpm离心15分钟,取上清液400ul置冷冻浓缩仪冻干。2.2超高效液相色谱分析:采用超高效液相色谱分析仪。冲洗柱采用10cm×2.1mm×1.7umc18柱根据梯度不同而改变的乙腈溶液冲洗,根据物质在柱内停留时间的长短,完成各种代谢产物的分离。2.3高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(uplc/ltq-orbitrapms):通过采用ltq-orbitrap质谱分析仪,对已经分离的代谢产物实行esi+模式操作。2.4处理数据和统计学分析:通过micromassmarkerlynx获取每峰停留时间(tr)和m/z数据对,标准化输出每峰离子密度后,进行主成分分析(pca)。根据非参检验结果,寻找差异比较大的代谢产物。spss.18进行统计学分析。2.5确定代谢产物名称:根据精确分子量来分析、研究确定代谢产物名称。结果:1.对慢性乙型肝炎34例进行肝脏穿刺进行病理检查,结果显示:s1:8例,s2:5例,s3:1例,s4:20例。其中s1-s3期14例,为慢性乙型肝炎组;s4期20例,为早期肝硬化组即代偿期肝硬化组。2.在对正常对照组、慢性乙型肝炎组、代偿期肝硬化组、失代偿期肝硬化组患者血清物质代谢谱的比较中发现,相对正常对照组,慢性乙型肝炎、代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化患者蛋氨酸呈逐渐下降趋势,辅酶Q1、羧乙基精氨酸、甘氨脱氧胆酸呈逐渐上升趋势。结论:蛋氨酸(Methionine)、辅酶Q1(coenzyme Q1)、羧乙基精氨酸(octopine)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)可作为肝纤维化的代谢标志物群。