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背景与目的：肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤,EGFR基因在肿瘤的发生发展过程中起着十分重要的作用。针对EGFR基因的分子靶向药物Gefitinib是最早进入临床研究的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)。已有的研究证明初始有效的患者经一段缓解期后部分出现疾病进展,即出现对Gefitinib的耐药。本研究以Gefitinib敏感细胞株PC9及其耐药子系细胞PC9/AB2、PC9/AB11、PC9/BB4为模型,检测四株细胞对Gefitinib的耐药指数,分析EGFR基因序列是否存在差异,研究EGFR基因mRNA水平表达量的差异,初步探讨了EGFR基因突变与Gefitinib耐药机制的可能。
方法：
1.应用细胞计数和MTT法测定细胞PC9、PC9/AB2、PC9/AB11、PC9/BB4的耐药指数。
2.提取4株细胞基因组DNA,应用PCR方法扩增4株细胞EGFR基因突变热点部位exon18～21,并进行测序,明确其基因序列。
3.提取4株细胞总RNA,经反转录后应用real-time PCR方法测定4株细胞EGFR基因在mRNA水平上的表达量差异。
4.应用流式细胞计数仪测定每株细胞IC50浓度时细胞凋亡程度。
结果：
1.验证了PC9及其三株耐药子系细胞耐药性差异,Gefitinib敏感细胞株PC9的耐药性与其三株耐药子系PC9/AB2、PC9/AB11、PC9/BB4差异明显,在100～250倍之间。三株耐药细胞株之间也存在明显的耐药性差异。
2.通过PCR进行DNA水平的检测,发现与野生型相比PC9及其三株耐药子系细胞均存在19外显子15bp缺失突变。耐药细胞株PC9/AB11外显子20存在A→G的点突变。
3.通过real-time PCR方法测定,敏感细胞株PC9的EGFR基因在mRNA水平上的表达量明显高于其他3株耐药株,说明耐药的发生与EGFR基因表达量有一定的关系。
4.在Iressa IC50浓度附近,PC9及其三株耐药子系均出现不同程度的凋亡,说明该药物也有一定的诱导凋亡作用。
结论：
(1)PC9、PC9/AB2、PC9/AB11和PC9/BB4肺癌细胞株对Gefitinib的耐药性存在非常显著的差异；
(2)四株肺癌细胞株均存在EGFR基因突变和EGFRmRNA表达水平改变；
(3)四株肺癌细胞株EGFR基因突变和mRNA表达水平的差异与其与Gefitinib获得性耐药有关。