安徽怀远地区大豆疫霉的鉴定及rDNA-ITS序列分析

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大豆疫病由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起,是一种世界性大豆病害,也是我国对外检疫性植物病害。本学位论文对安徽省怀远地区大豆疫霉进行分离,形态学和致病性鉴定以及致病型和核糖体DNA的ITS序列鉴定,取得的主要研究成果如下:1.采集怀远地区大豆田的土样34份,叶碟诱捕法后分离到7株疫霉菌株,检出频率为20.59%。从上述分离获得的7株大豆疫霉菌中选取3个具有代表性菌株(HY11、HY15、HY17)进行了形态学鉴定,结果表明,HY11、HY15、HY17在利马豆琼脂培养基(LBA)上生长缓慢,菌丝致密、无隔,形成菌丝膨大体,近直角分支,分支稍溢缩,菌丝直径在2.5-6.3μm。孢子囊顶生,倒梨形,不脱落,内层出,长宽比1.64(>1..6)。3个菌株都为同宗配合的,藏卵器球形,直径在25.0-41.3μm,雄器多侧生,偶见围生。查阅疫霉分类检索表,可以将上述分离物鉴定为大豆疫霉(P.sojae)。致病性测定后,所有菌株对合丰35大豆品种具有致病性,发病症状与田间大豆植株相同,参照柯赫氏法则可鉴定其为大豆疫霉。2.采用下胚轴接种法,将分离到的菌株接种在15个含有不同抗病基因的大豆植株上,结果表明,7个菌株分别属于7个不同的致病型:1d,2,3a,3b,3c,4,5,6,7,1d,3a,3b,3c,4,5,6,7,1d,3a,3b,3c,4,5,6,4,5,6,7,2,3c,4,5,6,7,3c,4,6,7和4,6,7。其中能克服9个抗病基因的菌株有1个,表明在怀远地区存在大豆疫病的较强毒性菌株;能克服Rps3c、Rps4、Rps5、Rps6和Rps7的菌株出现频率超过70%,说明它们在育种方面的价值不大,能克服Rps1d、Rps3a、和Rps3b的菌株出现频率均超过了40%,能克服Rps2的菌株数出现频率28.57%。3.采用ITS序列分析法对怀远地区大豆疫霉进行了分子鉴定:利用卵菌核糖体基因内转录间隔区(ITS)通用引物,对3个代表性菌株(HY11、HY15、HY17)进行PCR扩增,结果表明:3个供试菌株都可以得到1条大小约为300 bp的特异性扩增产物;再用大豆疫霉特异性引物对上述3个供试菌株进行PCR扩增然后进行序列测定;然后利用UPGMA法对供试菌株和GenBank中已登录的P.sojae、P.medicaginis、P.trifolii、P.palmivora、P.capsici、P.inpestans和P.cactorum等7个形态学种14个菌株的ITS碱基序列进行聚类分析。结果显示,供试的3个疫霉菌株的ITS序列皆一样长,而且核苷酸的碱基序列完全相同;且与GenBank中登录的大豆疫霉(P.sojae)菌株AY256844、AB688408、GU993914和GU259351的ITS序列的同源性高达100%。聚类结果表明,供试菌株HY11、HY15、HY17及GenBank中登录的大豆疫霉(P.sojae)AY256844、AY590274、AB688408、GU993914和GU259351成一组,且遗传相似性极高,与其他菌株间的遗传亲源关系较远。分子鉴定结果表明从怀远地区大豆田土样中分离获得的疫霉菌株为大豆疫霉(P.sojae)。
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