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WRKY家族是一类锌指型转录因子,可以调控植物中逆境信号的传导。利用同源比对的方法从494,195个小麦ESTs中获得43个WRKY类基因,命名为TaWRKY1-43,并对其编码蛋白进行了氨基酸序列分析及分类。以西峰20(耐旱)和石4185(对照)为供试小麦品种,利用RT-PCR分析43个基因在上述2个品种中干旱处理不同时间的表达特性,表明8个基因应答干旱胁迫,它们是:TaWRKY1、2、13、14、16、17、19和27,且其转录水平在品种间存在差异。继而用RT-PCR分析它们对旱、盐和冷等非生物逆境、伤害处理及植物激素ABA处理的应答模式,结果显示TaWRKY13、14、16和27只受旱绣导,TaWRKY1和17基因分别受旱、盐、冷、ABA,旱、冷、伤害、ABA诱导,TaWRKY2受冷抑制而受另外4种处理诱导,TaWRKY19受到5种处理诱导,它们的应答模式在逆境因子种类上均存在很大差异。
选取4个基因(TaWRKY1、2、17和19)用RT-PCR检测其在上述不同品系中对旱和盐的响应,表明4个基因在3种不同抗逆性品种中对不同非生物逆境胁迫的应答反应模式具有多样性,暗示了这些基因可能参与着复杂的逆境调控过程。用RT-PCR检测4个TaWRKYs在西峰20中的组织特异性表达,显示TaWRKY1在西峰20的根、茎和叶中组成型表达;TaWRKY2,17和19基因在西峰20的根、茎和叶中均有表达,但其表达水平具有组织特异性。通过RACE和拼接从西峰20中克隆得到8个旱胁迫应答基因的全长cDNA。分析了小麦、拟南芥、水稻和大麦WRKY基因家族中的WRKY蛋白的进化树,并对结构与功能的关系作了讨论。
用酵母及拟南芥原生质体系统中检测6个TaWRKYs是否具有转录激活活性,结果表明,TaWRKY1和13在酵母及拟南芥原生质体系统中均有转录激活活性,TaWRKY17只在酵母系统中显示转录激活活性,而TaWRKY2、14和16在两个系统中均没有检测到转录激活活性。酵母双杂实验表明上述6个蛋白均不能形成同源二聚体,只有TaWRKY2和17能形成异源二聚。TaWRKY1、2、17和19的凝胶迁移滞后实验说明它们能特异结合W box序列,表明它们是有活性的转录调控因子。
通过转基因方法在拟南芥中分别过量表达TaWRKY1、2和19并分析其表型。与野生型相比,TaWRKY1、2和19的转基因植株分别提高了抗冻性,耐旱性、耐盐性,耐旱性、耐盐性和抗冻性。通过检测脯氨酸、可溶性糖、电解质渗漏及丙二醛等生理指标讨论了3个基因参与调控转基因植物耐逆性的生理机制。
转基因植株中下游基因分析表明TaWRKY1上调Cor15A表达,下调STZ表达;TaWRKY2和19分别上调RD29B、STZ、P5CS1、RAB18,DREB2A、RD229B、CoR6.6、RD29A、ABF4和P5CS1的表达。3个TaWRKYs与上述上/下调基因启动子结合的凝胶迁移滞后实验表明,TaWRKY1、TaWRKY2和TaWRKY19能分别直接调控Cor15A、STZ,RD29B、STZ和Cor6.6、RD29B的表达,TaWRKY19调控RD29B但不通过DREB2A。
本论文筛选和克隆了小麦应答非生物胁迫的3个TaWRKY基因,研究了它们的生化特性,通过转基因实验表明,它们参与了植物的耐逆性调控。并对其调控途径进行了探讨。