论文部分内容阅读
目的:通过检测JAK2 V617F阳性HEL细胞及真性红细胞增多症(PV)患者造血细胞自噬水平,探索自噬调控对HEL细胞及PV患者造血细胞增殖的影响。方法:1.检测JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬活性:应用流式细胞术及吖啶橙(AO)染色法检测HEL细胞内LC3-蛋白的表达,以JAK2 V617F阴性K562细胞为对照;2.诱导或抑制JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬后检测细胞内LC3-Π蛋白的表达:自噬诱导剂雷帕霉素(终浓度为10μmol/L)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(终浓度10mmol/L)分别作用于HEL细胞48h后,流式细胞术和吖啶橙(AO)染色法检测HEL细胞内LC3-Π蛋白的表达。3.诱导或抑制JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R发光法检测细胞增殖活力:自噬诱导剂雷帕霉素(终浓度为10μmol/L)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(终浓度10mmol/L)分别作用于HEL细胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R发光法检测细胞增殖活力。4.检测JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞自噬活性:采集12例临床上确诊的JAK2 V617F阳性PV患者外周血,以15例健康体检者外周血为对照,流式细胞术和Western blot法检测JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达。5.诱导或抑制自噬后检测JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达:自噬诱导剂雷帕霉素(终浓度为10μmol/L)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(终浓度10mmol/L)分别作用于JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞48h后,流式细胞术和Western blot法检测细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达。6.诱导或抑制JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞自噬活性后Cell Titer-Glo○R发光法检测细胞增殖活力:自噬诱导剂雷帕霉素(终浓度为10μmol/L)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(终浓度10mmol/L)分别作用于JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞0h、12h、24h、48h后,Cell Titer-Glo○R发光法检测细胞增殖活力。结果:1.LC3-Ⅱ蛋白在HEL细胞内的表达水平流式细胞术检测HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白的平均荧光强度值明显高于JAK2 V617F阴性K562细胞,分别为(159388.67±29001.10)、(96046.67±24134.08)(P﹤0.05);AO染色荧光显微镜观察HEL细胞内自噬体形成明显高于K562细胞。2.自噬活性改变后JAK2 V617F阳性HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达流式细胞术检测结果显示对照组、雷帕霉素处理组、3-甲基腺嘌呤处理组三组细胞内LC3-II蛋白的平均荧光强度值分别为(95533.33±4273.56)、(268333.30±33560.89)、(20000.00±7285.60)(P﹤0.05)。3.自噬活性改变对JAK2 V617F阳性HEL细胞增殖活力的影响HEL细胞常规培养,于12h、24h、48h各时间点检测细胞活力,细胞呈增殖状态;自噬诱导剂雷帕霉素作用于HEL细胞12h、24h、48h后,各时间点检测细胞增殖活力较对照组对应各时间点明显增强(P﹤0.05);而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤作用于HEL细胞,于12h、24h、48h各时间点观察细胞增殖活力较对照组对应各时间点明显降低(P﹤0.05),48h时雷帕霉素处理组(101413.00±3 720.54)、3-MA处理组(5732.00±165.64)细胞增殖活力与对照组(29435.33±971.84)比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。4.JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达流式细胞术检测12例PV患者外周血中髓系细胞内LC3-Ⅱ蛋白平均荧光强度值明显高于15例健康体检者外周血髓系细胞,分别为(92841.67±4249.59)、(86633.33±2503.90)(P﹤0.05);Western blot检测3例PV患者外周血细胞内LC3-II蛋白表达高于健康体检者。5.诱导或抑制自噬对JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达的影响流式细胞术检测结果显示,对照组、雷帕霉素处理组、3-甲基腺嘌呤处理组三组髓系细胞内LC3-Ⅱ蛋白平均荧光强度值分别为(75433.33±10920.78)、(98000.00±2475.88)、(48733.33±6978.78),三组差异均有统计学意义(P﹤0.05);Western blot检测结果显示,3-MA处理组骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较对照组明显降低;雷帕霉素处理组骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较对照组升高。6.自噬活性改变对JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞增殖活力的影响PV患者骨髓细胞常规培养,随培养时间延长呈增殖趋势,应用雷帕霉素和3-MA分别诱导和抑制自噬,于0h、12h、24h、48h各时间点观察细胞增殖活力,结果显示,雷帕霉素和3-MA对PV患者骨髓细胞分别有促进和抑制细胞增殖的作用,与对照组对应各时间点比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05),48h时对照组、雷帕霉素处理组、3-MA处理组细胞增殖活力分别为(16200.33±680.00)、(18743.67±1015.09)、(5371.00±55.87),差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:1.JAK2 V617F阳性HEL细胞和PV患者造血细胞存在较高的基础自噬水平:JAK2 V617F阳性HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较JAK2 V617F阴性K562细胞明显增加;JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达表达明显高于健康体检者外周血细胞。2.上调自噬活性可促进JAK2 V617F阳性HEL细胞和PV患者骨髓细胞的增殖;下调自噬活性对JAK2 V617F阳性HEL细胞和PV患者骨髓细胞的增殖有明显抑制作用。3.自噬异常是真性红细胞增多症发生发展的病理生理学机制之一,自噬调控可能是PV治疗的新靶点。