高血压病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

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目的建立高血压病血瘀证血管内皮细胞损伤模型,观察模型细胞的活性、形态、超微结构及功能改变,为中医学病证结合细胞模型的建立提供方法学上的借鉴。方法1.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(20%、15%、10%、5%)高血压病血瘀证患者血清作用于人脐静脉内皮细胞(ECV-304)不同时间后(6h、12h、24h、48h)的活性,并最终确定建立模型的血清作用浓度为10%,作用时间为24h;观察不同浓度丹参酮ⅡA(TanⅡA)对10%浓度高血压病血瘀证患者血清损伤的ECV-304活性的影响;2.倒置相差显微镜观察模型细胞形态的改变,扫描电镜和透射电镜观察模型细胞超微结构的改变;观察10μg/ml丹参酮ⅡA对模型细胞形态、超微结构的影响;3.激光扫描共聚焦显微镜检测模型细胞胞浆游离钙浓度;观察10μg/ml丹参酮ⅡA对模型细胞胞浆游离钙浓度的影响;4.酶联免疫法(ELISA)定量检测模型细胞分泌的血管内皮细胞损伤标志物(vWF、TM、EPCR);观察不同浓度丹参酮ⅡA对模型细胞分泌vWF、TM、EPCR的影响;5.硝酸还原酶法检测模型细胞分泌的一氧化氮(NO)浓度,非平衡法测定模型细胞分泌的内皮素(ET);观察不同浓度丹参酮ⅡA对模型细胞分泌NO、ET的影响。结果1.血清作用24h时,血瘀组、非血瘀组细胞活性较健康组、对照组低,差异显著(P<0.05或P<0.01);10%、5%浓度时,血瘀组细胞活性较健康组低,差异显著(P<0.05或P<0.01);在10%浓度血瘀证患者血清作用于细胞的同时,加入TanⅡA,对细胞活性有保护作用,TanⅡA浓度为10μg/ml时作用比较明显:2.倒置相差显微镜检查发现:模型组细胞收缩变形,细胞间隙增大,胞浆中有暗色颗粒;透射电镜的观察结果发现:模型组细胞表面仅有细长的微绒毛,饮液泡数量增多,粗面内质网数目减少并有扩张,核糖体部分丢失,滑面内质网明显扩张呈空泡状,线粒体细小,嵴不清或消失:扫描电镜观察结果发现模型细胞收缩分离成放射星状体;3.模型组与健康组比较,荧光强度较大,差异显著(P<0.05),模型组与空白对照组比较,荧光强度较大,差异显著(P<0.01):模型组与非血瘀组比较,无显著差异(P>0.05);药物组与模型组比较,荧光强度较小,但无显著差异(P>0.05):4.模型组、非血瘀组、健康组分泌的vWF、TM、EPCR与对照组比较,分泌量较大;模型组、非血瘀组分泌的vWF、TM、EPCR与健康组比较,分泌量较大,其中,模型组与健康组比较,差异显著(P<0.05或P<0.01):TanⅡA的某些浓度可以减少模型细胞分泌的vWF、TM、EPCR,其分泌量与模型组比较,差异显著(P<0.05或P<0.01);5.模型组分泌的NO低于对照组、健康组,且差异显著(P<0.05或P<0.01);模型组分泌的ET高于对照组、健康组、非血瘀组,且差异显著(P<0.05或P<0.01);TanⅡA 40、20μg/ml剂量组分泌的NO较模型组低,10、5μg/ml剂量组分泌的NO较模型组高,但均无显著差异;TanⅡA 40μg/ml剂量组分泌的ET较模型组高,20、10、5μg/ml剂量组分泌的ET较模型组低,亦无显著差异。结论1.按照MTT法可以筛选高血压病血瘀证细胞模型复制的条件,具体为:高血压病血瘀证患者血清浓度为10%,作用时间为24h;2.模型细胞存在细胞活性、形态、结构及功能损伤;3.模型组细胞损伤较健康组严重;4.活血化瘀中药单体TanⅡA能减轻这种损伤;5.血瘀证患者血清对血管内皮细胞的损伤(体外改变)与血瘀证患者或血瘀证动物血管内皮细胞的损伤(体内改变)具有一致性;6.高血压病血瘀证血管内皮细胞损伤模型可以成功建立。
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