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钩端螺旋体(钩体)对宿主的侵袭引起的广泛出血是钩体病急性恶化致死的重要病症,但是造成这一严重后果的过程及其机理并不清楚。前期研究确认钩体自身编码类似哺乳动物的血小板激活因子乙酰水解酶(Platelet-activatingfactoracetylhydrolase,PAF-AH),其在一级和三级结构上类似于哺乳动物胞内PAF-AHⅠ型,但是底物特异性类似于血浆型PAF-AH。本研究推测钩体PAF-AH通过灭活血小板激活因子(Platelet-activatingfactor,PAF)的生理活性,阻止凝血过程中血小板的有效聚集,从而可能在导致宿主多脏器出血过程中起到某种作用。
通过对健康的人和13种常规的实验动物血清中PAF-AH的定量测定,发现各种动物本底血清中PAF-AH水平差异很大,而长爪沙鼠的本底血清中PAF-AH水平与健康人体最为接近。连续32天检测沙鼠血清中PAF-AH水平,发现其活性稳定。又使用已鉴定毒力的钩体感染沙鼠,发现沙鼠容易感染钩体,并且感染后具有钩体病典型的发病特点。因此,其适合作为研究PAF-AH在钩体病出血中作用的动物模型。
通过已经建立的钩体病完整病程的沙鼠模型,本研究发现钩体感染引起的沙鼠肺出血和死亡率密切相关,进一步数据显示宿主血清中PAF-AH总活力的变化和钩体病肺出血密切相关,并与钩体来源的PAF-AH无关。流行病学调查发现感染强毒株黄疸出血型钩体患者血清中的酶活高于感染非黄疸出血型钩体患者血清中的酶活,而感染非黄疸出血型钩体的患者血清中的酶活类似于健康人血清中的酶活。因此,血清中PAF-AH活力可以作为钩体病肺出血的潜在临床检测指标,有助于改善对钩体病预后的监测和及时采取措施,从而防止急性恶化的发生,降低死亡率。另外,本研究推测宿主PAF-AH,即胞内PAF-AHⅠ型的泄漏或血浆型PAF-AH的上调引起血清中PAF-AH总活力的升高。
为此,本研究在大肠杆菌中克隆、表达和纯化了人Ⅰ型PAF-AH,发现重组人Ⅰ型PAF-AH能水解血浆型PAF-AH商业化的底物之一--2-ThioPAF,但是不能水解人血浆型PAF-AH的另外一个商业化底物--1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine。因此,利用Ⅰ型PAF-AH和血浆型PAF-AH对两个商业化底物的底物特异性不同,可以快速区分人Ⅰ型PAF-AH和血浆型PAF-AH,从而为后续鉴定钩体感染后血清中宿主PAF-AH的类型--血浆型或Ⅰ型PAF-AH,分析各个类型PAF-AH的含量提供技术手段。