耐受高浓度糠醛产L-乳酸菌株的筛选鉴定及其对纤维素水解液的发酵工艺研究

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聚乳酸作为石油化学制品的良好替代品,聚乳酸的需求量日益增长。微生物发酵法通过优良菌种对廉价底物的高效利用能生产专一性的高光学纯乳酸,是大规模生产乳酸的主要方法。本论文就针对高光学纯L-乳酸的高效低成本发酵开展研究。本文旨在以高浓度糠醛作为筛选条件,对本实验室保存的污水样品进行筛选,从而筛选出耐受高浓度糠醛产L-乳酸的菌株,并结合形态学观察、生理生化鉴定以及16S rRNA基因同源性分析等生物学方法对获得的耐受高浓度糠醛产L-乳酸菌株进行鉴定,优化目的菌株利用纤维素水解液发酵的条件,并开展利用纤维素水解液和棉籽蛋白粉作为廉价碳氮源发酵生产L-乳酸的工艺研究,取得了较高的发酵水平,并显著降低了L-乳酸的原料成本。本实验的主要实验方法和实验结果如下:1、利用纤维素水解液平板和糠醛浓度梯度平板,对本实验室保存的污水处理厂活性底泥样品进行筛选,最终获得一株耐受高浓度糠醛产L-乳酸菌株P38。2、对P38号菌进行菌落形态观察和个体形态观察、生理生化鉴定以及16S rRNA基因鉴定等研究。革兰氏染色及显微观察的结果显示P38不论在个体形态、菌落的主要特征还是生理生化特点等方面均与凝结芽孢杆菌相似。为了进一步确定菌株的种属,实验提取了P38的基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因序列并在NCBI网站中进行同源性分析比较,发现P38与前几株凝结芽孢杆菌的同源性高达99%。因此将P38鉴定为凝结芽孢杆菌。3、探究凝结芽孢杆菌P38对葡萄糖和木糖的利用情况,进行了分别以葡萄糖和木糖为唯-碳源以及混合碳源的利用实验,结果显示,当以葡萄糖作为唯-碳源生产乳酸,产量为0.99±0.02g/g,光学纯度99.9%,发酵为同型发酵;当以木糖为唯-碳源生产乳酸,产量为0.89±0.04g/g;P38可以同时高效利用木糖和葡萄糖。4、探究凝结芽孢杆菌P38对发酵抑制物的耐受情况,选择实验的发酵抑制物分别为乙酸、甲酸、香草醛、木质素、糠醛。实验结果表明,P38对糠醛有显著地耐受能力,可以耐受高达10g/l的糠醛浓度,只有当糠醛浓度超过6g/l时,葡萄糖的消耗和乳酸的生产才会受到明显的抑制,P38还对弱酸及酚类化合物有极强的耐受能力。5、为了提高高光纯L-乳酸的产量,本实验对凝结芽孢杆菌P38的发酵条件进行优化。从而确定优化后的发酵条件为:发酵温度42℃,初糖浓度100g/l。6、在优化的最佳条件下对玉米秸秆水解液进行分批补料发酵实验。L-乳酸的终浓度为180g/l,糖酸转化率为96%,产率为2.4g/l/h,L-乳酸的光学纯度大于99%。7、蔗渣水解液开放式分批补料发酵研究。优化得到凝结芽孢杆菌P38发酵生产高纯L-乳酸的最佳发酵培养基(g/l):初始还原糖90,棉籽蛋白40,中性蛋白酶0.3,碳酸钙54。L-乳酸的终浓度为199g/l,糖酸转化率为99%,产率为1.93g/l/h,L-乳酸的光学纯度大于99%,符合工业对乳酸的聚合要求,显著降低了L-乳酸的生产成本。
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