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刺槐(Robinia pseudoacacia Linn.)又名洋槐,属于豆科(Leguminosae)刺槐属(Robinia L.)落叶乔木,原产美国,具有较强的适应性。四倍体刺槐(Tetraploid Robinia pseudoacacia Linn.)也称多倍体刺槐,是由人工诱导二倍体刺槐染色体加倍而育成的优良树种。与二倍体刺槐相比,四倍体刺槐各项指标均优于二倍体,具有耐盐碱、耐干旱、抗病虫害能力强等特点。凝集素(lectin)是一类广泛存在于动物、植物和微生物中,调控着保护及防御等生物学过程。本研究利用分子生物技术,从盐胁迫的四倍体刺槐中克隆得到一个凝集素基因TRpL1,通过荧光定量、原核表达等方法对其进行了一系列生理生化与分子生物学研究,得到的结果如下: (1)利用生物信息学方法分析TRpL1蛋白的结构特点,预测了信号肽、结构域、亚细胞定位、修饰位点等,发现其定位在叶绿体或细胞膜中。 (2)构建了重组蛋白原核表达载体pQE-TRpL1,并优化了pQE-TRpL1蛋白的表达条件,结果显示TRpL1蛋白原核表达的最佳条件是:诱导温度为28℃,诱导4小时,诱导剂IPTG浓度为0.1mM。在此条件下表达并纯化得到约10.8g纯度约95%的TRpL1蛋白,并送交生物公司制备抗体,为后续的盐碱胁迫下转基因植株中TRpL1的蛋白表达谱研究奠定了基础。 (3)利用原核表达模型考察了TRpL1蛋白表达提高大肠杆菌抵抗盐胁迫的能力。通过测定在0-12h内,分别携有pQE-TRpL1质粒和pQE-30空载体的M15菌株,在不同浓度的NaCl(0、400、600、800、1000mM)胁迫下的生长量(OD600)来考察其对盐胁迫的耐受性。结果表明,在对照条件下,pQE-TRpL1和pQE-30的生长曲线基本一致;在NaCl胁迫下,pQE-TRpL1的生长高于pQE-30空载体。这说明TRpL1蛋白的表达可以提高大肠杆菌对盐的耐受性。 (4)采用q-PCR方法分析了盐碱胁迫下TRpL1基因在刺槐叶片中的表达谱。结果表明,与对照相比,400mM NaCl处理后的二倍体和四倍体刺槐中TRpL1基因表达量都有所升高,但在四倍体中的表达量高于二倍体,推测二倍体和四倍体刺槐中的TRpL1都响应NaCl盐胁迫,但四倍体刺槐中TRpL1对盐胁迫胁迫的响应可能比二倍体刺槐更加敏感,这种表达差异或者与四倍体刺槐耐盐能力高于二倍体有关。200mM NaHCO3胁迫后,二倍体和四倍体TRpL1表达量均略有升高,但与对照相差不大,推测可能是植物对NaHCO3胁迫与NaCl胁迫的响应机制不同,二倍体和四倍体中TRpL1对NaHCO3胁迫响应不明显。 (5).构建了植物过表达载体35S∷TRpL1-GFP,制备拟南芥转基因植株,获得了T3代转基因植株,转基因幼苗耐盐性实验初步证明了TRpL1可能提高了拟南芥的耐盐性,为后续深入探究TRpL1基因的耐盐碱功能提供了基础。