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CUP-SHAPED COTYLEDON 2(CUC2)基因是植物NAC(NAM/ATAF/CUC)家族转录因子之一,其在顶端分生组织的形成、器官生长位置及边界的确立、腋生分生组织形成和叶形变异等过程中发挥重要作用。目前,该基因的功能挖掘大多集中在模式植物中,而在木本植物中的研究鲜见报道。本研究团队前期在对两种不同叶形和株型的桦树,裂叶桦(Betula pendula’Dalecarlica’)和欧洲白桦Betula pendula),叶片转录组分析时发现众多关键基因,其中BpCUC2基因在裂叶桦中显著上调表达。为了揭示BpCUC2的分子功能,本研究对该基因进行了组织表达特性、生物信息学分析,对获得的转基因株系进行表型特性分析和解剖学观察,并采用转录组测序、酵母单杂交(Yeast one-hybrid)和 ChIP-PCR(Chromatin Immunoprecipitation-PCR)等技术筛选和验证其上游及下游调控基因。另外,对该基因的上游调控基因BpmiR164(BpmicroRNA164)进行了组织表达特性和生物信息学分析,并进行遗传转化。研究结果如下:(1)生物信息学和组织表达特性分析表明,BpCUC2具有NAC家族典型的A、B、C、D和E保守亚结构域,并在顶芽中呈高表达,而在根中呈低表达。亚细胞定位结果显示,BpCUC2基因定位在细胞核中。转录激活域分析表明,BpCUC2转录因子在基因C端748-906 bp之间具有重要的转录激活结构域。(2)通过白桦的遗传转化,获得3个BpCUC2超表达株系(OE1-OE3)。与野生型白桦(WT)相比,超表达株系在苗高、节间和叶形等性状上表现出明显的缺陷。观察发现,超表达株系的苗高降低,仅为WT的37.7%、40.7%和24%,其具有较短的速生期和较慢的生长速率。在节间性状上,超表达株系节间数目减少为WT的78.3%、74%和39%;节间距缩短,WT中90%以上节间距在1.5 cm～2.5 cm之间,而3个转基因株系其节间长度60%以上均小于1 cm。在节间细胞长度上,超表达株系的节间表皮细胞和茎内部细胞长度均为WT的50%左右。在叶形性状上,和WT相比,超表达株系叶片叶缘缺刻减少,叶片一级齿和二级齿数目减少,甚至不具有三级齿,同时叶片长宽比增大,叶基角减小,然而,叶片光合荧光参数和WT相比没有发生变化。此外,在顶芽形态上,超表达株系由于顶芽处叶柄与茎融合导致顶芽呈近90°弯钩状。解剖学分析结果显示,顶端分生组织大小在转基因株系和WT之间未发生改变。(3)内源激素含量测定结果显示,与WT相比,生长素(Indoleacetic Acid)在过表达株系中降低,而细胞分裂素(Zeatin)在过表达株系中升高。免疫组织化学定位结果显示,与WT相比,生长素的分布在过表达株系的顶芽和茎中未发生明显改变。(4)根据BpCUC2过表达白桦转录组测序结果,相比于WT,超表达株系中有688个差异基因(533个上调表达,155个下调表达),这些基因主要与植物激素信号转导、激素代谢和生长调节等过程有关。其中,很多与细胞周期蛋白、生长素响应和合成等有关的基因呈现显著的上调表达。进一步,由以转录因子为核心的酵母反式单杂交(TF-Centered Yeast One Hybrid)和酵母单杂交瞬时转化验证实验结果可知,BpCUC2可能结合的顺式作用元件为CGT[A/G]、LTRECOREATCOR15(CCGAC)、CAREOSREP1(CAACTC)和 BIHD1OS(TGTCA)。另外,ChIP-PCR 结果显示,BpCUC2能够直接调控一系列与细胞周期蛋白、生长素响应和合成等有关的基因表达。(5)5’RACE实验表明,BpCUC2为BpmiR164的靶基因,且mRNA切割位点位于其互补序列的第11和第12位之间。本研究中,BpmiR164有4条前体序列(BpmiR164a、BpmiR164b、BpmiR164c 和 BpmiR164d)以及 2 条成熟序列(BpmiR164-1和BpmiR164-2)。基因表达特性分析表明,BpmiR164d主要在幼叶齿尖和成熟叶片中表达。通过农杆菌介导的合子胚法遗传转化,获得3个BpmiR164抑制表达株系。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,与WT相比,BpCUC2在BpmiR164抑制表达株系中的表达量升高。在株高和节间性状上,虽然和BpCUC2超表达株系相比表型缺陷程度较弱,但3个BpmiR164抑制表达株系均显著低于WT(STTM-BpmiR1 64-2除外),株高分别为WT的61.3%、87.2%和68.6%;节间数目分别为WT的73.4%、80%和70%;平均节间距分别为WT的80%、98%和84.7%。综上所述,BpCUC2是调控白桦叶形和节间发育的重要参与者,BpmiR164是BpCUC2的一个负调控因子,同时,BpCUC2主要作用于一系列与细胞周期蛋白、生长素响应和合成等有关的基因。因此,该调控关系的存在通过调节内源激素含量的稳态和节间表皮细胞的大小,从而参与白桦叶形和节间的发育。本研究结果揭示了BpCUC2在白桦叶形及节间发育过程中的重要作用,为白桦分子设计育种和品种改良提供理论参考。