I.华支睾吸虫与乙型肝炎病毒感染的相互作用华支睾吸虫病(Clonorchiasis)是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,C.sinensis)寄生于人体肝胆管内所引起的人兽共患病,是我国重要的食源性寄生虫病,人因食入含有华支睾吸虫活囊蚴而感染,全球约有3500万人感染华支睾吸虫,其中约1249万人分布在中国。华支睾吸虫的感染可导致胆囊炎、胆管炎、肝纤维化甚至肝胆管癌和原发性肝细胞癌,相关的研究显示华支睾吸虫是原发性肝细胞癌的发生过程中不可忽略的诱发因素之一。乙型肝炎病毒感染呈全球性分布,是世界范围内重要的公共健康问题,尽管现在乙肝疫苗较为普及,全球约有3.5亿人是乙肝病毒携带者,其中我国近1亿人为无症状表面抗原携带者,人在感染乙肝病毒后,30%-50%发展成为慢性乙肝,进而发展成肝硬化,甚至肝癌。这两种疾病都会对肝脏造成损伤,最终有可能发展成肝细胞癌。相关流行病学调查显示在华支睾吸虫病高度流行区域的HBs Ag表面抗原阳性率远远高于华支睾吸虫病非流行区域,但是目前关于华支睾吸虫感染与乙型肝炎病毒感染的相互关系尚不明确。因此本研究首先分析合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染患者与单纯乙肝病毒感染患者及单纯华支睾吸虫病感染患者在肝脏受损程度上是否在差异,并分析合并华支睾吸虫感染对乙肝患者抗病毒治疗的影响,以及初步探讨华支睾吸虫合并乙型病毒感染致肝脏损伤的原因。研究目的华支睾吸虫感染合并乙型肝炎病毒感染致肝脏损伤原因的初步探讨研究方法与结果1.病例选择的标准首先通过对2014年7月至2015年2月期间于中山大学附属第三医院就诊的门诊及住院患者的病例按照以下3项标准纳入单纯乙肝患者病例组:1)年龄:满18周岁,男女不限;2)血清学HBs Ag阳性;3)血清学HBV DNA拷贝数≥20IU/ml;在以上3项标准的基础上,在粪检中检出华支睾吸虫虫卵的患者纳入合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染患者病例组;并且,以在粪检中检出华支睾吸虫虫卵及血清学HBs Ag阴性患者为单纯华支睾吸虫患者组;同时,以未在粪检中检出华支睾吸虫虫卵及血清学HBs Ag阴性的正常人作为对照组;除此以外,按照以下四项标准排除其余病例:1)合并HIV、HAV、HCV、HDV等其他肝炎病毒感染患者;2)酒精肝性患者;3)自身免疫性疾病患者;4)合并其他蠕虫及原虫感染患者;5)一、二型糖尿病患者;6)妊娠或者哺乳期女性。2.合并感染患者与单纯乙肝患者的肝功能的比较由于两种疾病都最终作用于肝脏,因此通过比较肝功能来分析合并华支睾吸虫感染对乙肝患者的影响。评价肝功能主要观察指标为血清学为谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TB)(其中ALT和AST均采用赖氏法,正常值分别为3-35U/L和15-40U/L,TB正常值为4.0-23.9umol/L),ALT和AST>2倍正常上限值,TB>3倍正常上限值视为肝功能损害。同时比较血清中HBV DNA的含量差异(正常值为阴性)。根据纳入标准一共有701例病人被纳入分析,其中520例病人为单纯乙肝患者,51例病人为合并感染患者,53例病例为单穿华支睾吸虫感染患者,并且随机选取77例正常人作为对照组。其中男性合并感染患者的人数远远高于女性感染患者。合并感染患者血清中ALT,AST,TB和HBV DNA水平明显高于单纯乙肝患者以及单纯华支睾吸虫感染患者组,提示合并感染患者的肝功能损伤严重及合并华支睾吸虫感染会加剧病程的发展。3.华支睾吸虫感染度与HBV DNA拷贝数的关系华支睾吸虫感染程度由粪检中检测到虫卵数所决定,而合并感染患者呈现高HBV DNA拷贝数,进一步分析华支睾吸虫感染程度是否与HBV DNA复制量有关系。本研究所收集到的合并感染患者都是轻度感染华支睾吸虫,在轻度感染时,HBV DNA的复制量并没有随虫卵数的增加而增加;然而HBV DNA复制量小于106次方时在粪检中虫卵的数量要明显高于复制量大于106次方时,说明HBV DNA高复制量有可能会抑制虫卵从机体中排出。4.合并华支睾吸虫感染对抗病毒治疗的影响选取合并感染患者,按照接受恩替卡韦(ETV)抗病毒治疗的基础上是否接受吡喹酮(PZQ)驱虫治疗分为联合治疗和单纯抗病毒治疗组,比较两组病人在接受一个疗程的治疗后的肝功能相关指标以及HBV DNA水平。结果显示合并感染患者在接受一个疗程的治疗后,接受驱虫和抗病毒联合治疗的合并感染患者的TB和HBV DNA水平明显低于单一抗病毒治疗组,然而ALT与AST水平在两组之间没有统计学差异,提示合并华支睾吸虫感染可能会减弱抗病毒治疗的疗效。5.华支睾吸虫ESP对乙肝病毒复制的影响用含有2x106 HBV DNA的乙肝患者血清与华支睾吸虫ESP(20ug/ml)共同孵育感染正常人外周血单个核细胞,以乙肝患者血清单独感染为对照组,感染48小时后检测细胞培养上清中HBV DNA拷贝数。结果显示培养48小时后,混合感染组的HBV DNA拷贝数明显高于单纯乙肝患者血清组,提示ESP有可能会增强乙肝病毒在外周血单个核细胞中的复制。6.华支睾吸虫ESP对宿主细胞因子表达的影响用华支睾吸虫ESP与乙肝患者血清共同孵育感染外周血单个核细胞,培养48小时后Real Time PCR法和ELISA法分别检测细胞中和细胞上清中细胞因子的表达,以正常培养的细胞做对照组。Real-Time PCR结果显示单纯乙肝患者血清实验组和单独华支睾吸虫ESP实验组都能诱导PBMC表达Th1型和Th2型细胞因子,ESP实验组以Th2型细胞因子为主;并且相对单纯乙肝患者血清实验组而言,ESP与乙肝患者血清混合物实验组的Th2型细胞因子包括IL-4,IL-6和IL-10水平明显增高,然而在Th1型细胞因子包括IL-2和IFN-γ在两组之间没有统计学差异。ELISA结果显示与乙肝患者血清刺激PBMC相比,用ESP与乙肝患者血清混合刺激PBMC分泌的IFN-γ水平明显降低,但是IL-4,IL-6和IL-10的表达水平是明显增高,上述结果提示华支睾吸虫ESP存在的前提下,细胞因子的表达可能由Th1型转向Th2型,提示合并华支睾吸虫感染时会加剧机体Th1/Th2细胞因子失衡的状态。7.感染患者血清学中细胞因子表达的变化收集合并感染患者、乙肝患者和华支睾吸虫患者接受治疗前的血清,分析相关细胞因子在三者血清学上的表达变化,以正常健康人作为对照组。结果显示,华支睾吸虫感染患者血清学中主要以Th2型细胞因子为主,而乙肝患者的IFN-γ在合并感染患者中的表达水平都要比乙肝患者和华支睾吸虫感染患者低,而细胞因子IL-2和IL-4在合并感染患者中要比乙型肝炎患者低,但并不具有统计学差异。而IL-10和IL-6在合并感染患者中的表达水平要比乙肝患者要明显增高,并具有统计学意义。8.研究结论在乙肝病毒感染时合并华支睾吸虫感染会加剧肝脏损伤进而影响肝功能,而且会削弱抗病毒治疗疗效;华支睾吸虫的ESP有助于乙肝病毒的复制;合并华支睾吸虫与乙肝病毒感染时会加剧机体Th1/Th2细胞因子失衡,并且可能以Th2型细胞免疫应答为主从而影响病毒的清除。II.EBOV的DNA疫苗免疫保护作用研究埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是单股负链RNA病毒,与马尔堡病毒同属丝状病毒科,该病毒是埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever,EHF)的病原体,能引起人类和非人类灵长类动物的一种急性出血性传染病,感染后死亡率高达90%。EBOV于1967年被首次发现,目前全世界仍然缺乏有效的治疗性或者预防性EBOV疫苗,其被列为生物安全等级四级(BSL-4)病毒,具有作为生化武器的潜力。目前,我国尚未发现该病,但随着世界经济的发展,EBOV也有传入我国的潜在危险,因此,对EBOV疫苗的相关研究具有重大的意义。EBOV含有7个基因,其基因组能编码8种蛋白;其中EBOV的第四个基因GP基因具有两个阅读编码框,未经m RNA编辑的GP基因主要编码s GP蛋白,含量约为80%;由于m RNA的编辑作用编码产生GP蛋白(Glycoprotein,GP),GP糖蛋白是由于在m RNA编辑位点处插入一个腺苷残基,从而导致编码框移从而产生GP糖蛋白,含量约为20%。大量的研究表明作为埃博拉病毒表面唯一的跨膜蛋白GP是诱导机体产生保护性中和抗体的主要蛋白,然而关于s GP在病毒感染过程中的具体功能还未有详细的研究。关于其他病毒的分泌性糖蛋白s GP的相关研究表明其有可能结合特异性中和抗体从而逃避宿主的免疫攻击以及干扰抗体介导的病毒清除,然而还未有足够的研究关于EBOV的分泌性糖蛋白s GP的相关功能。研究目的探讨埃博拉病毒分泌型s GP蛋白在病毒感染中的相关机制方法和结论1.埃博拉病毒GP基因编辑位点点突变免疫原性分析通过利用PCR定点突变技术对扎伊尔型埃博拉病毒的GP基因的m RNA编辑位点7个连续的腺苷后插入一个腺苷从而获得连续8个腺苷获得GP-8A,主要表达GP1,2;为了消除转录过程中由于聚合酶的滑移作用的影响,在7个连续腺苷处进行了沉默点突变由A突变为G获得s GP1,2 Edit,其完全表达s GP蛋白;同样在GP-8A基因的基础上也进行沉默点突变由A变为G获得GP1,2Edit完全表达GP1,2蛋白;再将上述基因克隆至真核p CAGGs载体并测序鉴定。随后,我们将真核质粒转染Hela细胞,24小时后收集上清和细胞,利用Western blot方法检测到s GP蛋白和GP蛋白的表达,结果表明在编辑位点处进行点突变有助于蛋白表达的增加。随后,我们用上述获得的真核表达质粒以肌肉注射的途径免疫小鼠,收集免疫后小鼠血清,利用ELISA检测血清中特异性抗体的滴度,结果显示s GP Edit和GP-7A诱导小鼠产生特异性s GP抗体水平要明显高于EBO-GP1.2 Edit和GP-8A,而EBO-GP1.2 Edit和GP-8A诱导小鼠产生特异性GP抗体水平要明显高于s GP Edit和GP-7A。2.s GP可以与GP蛋白竞争结合由s GP免疫诱导产生的GP抗体由于s GP和GP1.2都可以诱导小鼠产生s GP抗体和GP抗体,我们利用western blot技术进一步分析GP1.2和s GP诱导产生的抗体所针对的抗原表位是否一致,结果显示s GP免疫血清识别s GP蛋白的能力要明显强于GP蛋白,而GP免疫血清识别GP蛋白的能力要明显强于s GP蛋白,表明GP1.2诱导产生的GP抗体所针对抗原表位并不存在于s GP上。接着我们利用竞争性ELISA方法检测s GP蛋白与GP蛋白竞争结合GP抗体的能力,结果显示s GP蛋白能够与GP蛋白竞争结合s GP免疫诱导产生的GP抗体,然而不能竞争结合GP免疫诱导产生的GP抗体,提示GP免疫诱导产生的GP抗体所针对的抗原表位只特定存在于GP蛋白上,而s GP免疫诱导产生的GP抗体所针对的抗原表位是s GP与GP共享的抗原表位。3.抗体中和能力分析中和抗体是抗病毒免疫和评价疫苗免疫治疗效果的重要检测指标之一,我们利用假病毒中和实验体系检测s GP和GP诱导产生中和抗体的区别,首先我们用p SG3?env质粒与埃博拉病毒膜蛋白的GP质粒共同转染293T细胞包装形成埃博拉假病毒,然后用不同稀释倍数的免疫组血清与500pfu/ml的假病毒共同孵育1小时后感染TZM-bl细胞,48小时通过检测细胞内荧光素酶的表达,结果显示s GP和GP诱导产生的抗体均具有中和假病毒的能力,而且GP免疫组所产生的中和抗体活性高于s GP免疫组。接着,我们通过竞争性中和实验进一步检测s GP蛋白干扰抗体中和病毒的能力,结果显示s GP蛋白能够完全减弱s GP Edit免疫组抗体中和假病毒的活性,并且这种能力随着s GP蛋白浓度的增加而增强;然而,s GP蛋白干扰抗体的中和活性并没有在GP Edit免疫组有所体现。4.小鼠的免疫及攻毒实验为了探讨s GP和GP1,2在保护小鼠抵抗致死剂量埃博拉病毒攻击感染上是否存在差异,我们用s GP和GP1,2以肌肉注射的途径免疫小鼠,初免4周后以同样的剂量及方式行加强免疫一次,加强免疫四周后,其中两组予以交叉免疫即s GP免疫组予以GP加强免疫,而GP免疫组予以s GP交叉免疫,另两组分别予以相同的抗原再次加强免疫一次,还有两组不再加强免疫。免疫12周后小鼠经腹腔注射含有1000pfu的同源鼠适应埃博拉病毒进行攻毒。首先检测免疫后抗体滴度的变化,ELISA结果显示3次GP免疫后均可提高GP抗体产生水平且明显高于GP-s GP交叉免疫组,3次s GP免疫后均可提高s GP抗体产生水平且明显高于s GP-GP交叉免疫组,并且在两组交叉免疫组能明显增加s GP抗体水平。接着,中和实验结果显示2次同源免疫诱导产生的抗体均具有中和假病毒的活性,3次s GP和3次GP免疫组的抗体中和活性有明显增加,但是交叉免疫组的抗体中和活性并没有增加。最后,攻毒实验显示2次s GP免疫组只有1只老鼠存活,3只小鼠和1只小鼠分别在攻毒第5天和第8天死亡,其余免疫组除对照组外均存活;然而,只有在3次GP免疫组和GP-s GP免疫组的小鼠仍保持健康状态外其余免疫组小鼠伴有10-15%的体重下降以及疾病状态。5.研究结论在GP基因的m RNA编辑位点处获得GP1.2和s GP,进行点突变可明显增加s GP和GP蛋白的表达水平,并且s GP和GP分别诱导机体产生特异性GP和s GP抗体水平,并且s GP和GP诱导产生的抗体具有中和假病毒的活性,高水平的特异性GP抗体是保护小鼠抵抗致死剂量埃博拉病毒攻击的关键。