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研究背景结直肠癌是当今中国最常见的恶性肿瘤之一,在我国的发病率和死亡率高居第4位,并以每年4%的速度在沿海城市中递增。在美国,结直肠癌的发病率位居肿瘤发病率的第三位并且结直肠癌是第二位导致肿瘤患者死亡的癌症[3]。在全球,结直肠癌的每年新发病例为120万例,约有20%的患者在初诊时即发现有远处脏器的转移,而确诊后的5年生存率仅为55%。结直肠癌的演变过程是从正常粘膜到不典型增生、腺瘤样变、癌变到癌灶转移的经典“正常粘膜-腺瘤-癌变”转变过程。大量基因突变、错配,抑癌基因失活及癌基因活化等参与到了结直肠癌的转归过程中。然而结直肠癌的病因还尚未完全明确。目前有学者指出微卫星不稳定性(Microsatellite instability, MSI)是一种参与结直肠癌演变过程的重要分子机制[6],微卫星不稳定性和肿瘤之间的关系也是近年来肿瘤学研究的热点之一。微卫星不稳定性在结直肠癌的发展和演变过程中起到极其重要的作用,并且15%的结直肠癌患者具有微卫星不稳定性的特征,为微卫星不稳定型结直肠癌。错配修复系统功能丧失导致基因突变率升高是微卫星不稳定型结直肠癌发生发展的一个重要因素。虽然有学说指出微卫星不稳定型结直肠癌具有更少的淋巴结及远处转移的倾向,具有更好的预后。但是在2012年美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)出版的结肠癌临床实践指南(NCCN Guidelines Version2.2012)中明确指出二期微卫星不稳定型结直肠癌患者不能从5-氟尿嘧啶(5-Fu)的新辅助化疗方案中受益,并且微卫星不稳定性的检测可对依立替康和5-氟尿嘧啶为基础的结肠癌化疗方案的效果进行预测。但目前微卫星不稳定性介导的结肠癌蛋白质水平的变化及细胞信号传导通路的改变还不明确。与微卫星不稳定性相比,kras基因同样为结直肠癌的潜在预测分子标记物,不但能预测结直肠癌患者的治疗效果还能推测结直肠癌患者的预后。kras基因的活化方式主要通过点突变,而在结直肠癌中绝大部分kras基因的点突变位点为：第12、13密码子,约占88%。kras基因突变通常发生在结直肠小腺瘤向大腺瘤韵进展过程中,表明kras基因突变与微卫星不稳定性同为结直肠肿瘤的早期分子事件,在结直肠癌的发展过程中起到重要的作用。目的目前有一些学说指出Mucin5(MUC5AC), apoptosis-related gene (CASP2)和cycliin D1等基因信号传导通路在微卫星不稳定型结直肠癌中发生改变。虽然针对基因水平的检测工具(例如基因芯片)对微卫星不稳定型结直肠癌的研究越来越广泛。但是,大多数这些学说都只是涉及了微卫星不稳定型结直肠癌特定基因表达的某些侧面,它们并没有反映出肿瘤形成及进展的本质生物学特性。这是因为DNA水平或mRNA水平不能精确地反映出蛋白质水平和磷酸化的蛋白质分子状态,也不能反映出在分子转录水平的蛋白质改变和蛋白质分子降解水平上的改变。然而目前还没有学说应用蛋白质组学手段检测微卫星不稳定型结直肠癌的蛋白质表达差异,蛋白质信号传导通路的变化情况及其之间的相互作用。因此本学说借助蛋白质芯片(Protein Pathway Array, PPA)技术,基于微卫星不稳定型结直肠癌细胞株模型对微卫星不稳定型结直肠癌的蛋白质分子进行大规模筛选。期望寻找到潜在的微卫星不稳定型结直肠癌蛋白质水平的分子生物学标记物,为微卫星不稳定型结直肠癌的临床诊断寻找潜在的分子水平诊治依据。同时探索kras突变型结直肠癌信号传导通路的改变情况。材料和方法本学说采用从美国模式培养物研究所(American Type Culture Collection, ATCC)购买的HCT15, HCT116, HT29SW620, SW480and Caco-2细胞株作为结肠癌研究模型,其中HCT15和HCT116结肠癌细胞株作为微卫星不稳定型结肠癌的模型,HT29SW620, SW480和Caco-2结肠癌细胞株作为微卫星稳定型结肠癌的模型。在微卫星稳定型结肠癌的模型中HT29为kras野生型微卫星稳定型结肠癌细胞株,SW620, SW480和Caco-2为kras突变的微卫星稳定型结肠癌细胞株。我们借助Protein Pathway Array (PPA)高通量蛋白质检测芯片,对110个磷酸化和非磷酸化蛋白质的表达进行检测,找出微卫星不稳定型结肠癌和kras突变的微卫星稳定型结肠癌细胞株中的差异表达的蛋白质。应用蛋白组学数据库分析平台：Ingenuity Pathway Analysis (IPA)对在两组中差异表达的蛋白质进行信号传导通路研究,分析差异蛋白质之间的相互作用及其背后通路的改变情况。最终应用IPA建立微卫星不稳定型结肠癌中细胞信号传导网络模型,刻画出完整的细胞信号通路变化情况。结果1.在110种检测的磷酸化和非磷酸化蛋白质中,43种蛋白质在微卫星不稳定型结直肠癌细胞株(HCT15和HCT116)和微卫星稳定型结直肠癌细胞株(HT29SW620, SW480和Caco-2)中检测到有表达。其中共检测出25个磷酸化和非磷酸化蛋白质大于1.5倍变化。17个上调蛋白为：p-Smadl/5(Ser463/465), Survivin, p-HGF R/c-MET (Y1234/1235), p-PKCa (Ser657), E-cadherin, PTEN, TNF-a, p-PTEN (Ser380), p-HGF R/c-MET (Y1003), p-p90RSK (Ser380), NF-κB p65, CyclinE, cdc2p34, p-β-Catenin (Ser33/37/Thr41), Bcl-6, p-p70S6Kinase(Thr389)和p-PKC a/βⅡ (Thr638/641)。8个下调蛋白为：14-3-3(3, p-p53(Ser392), Cdk2, p53, raf-1, Cdk6, PKCa,和Hsp90。2.在110种检测的磷酸化和非磷酸化蛋白质中,64种蛋白质在kras突变型结肠癌细胞株(SW480、SW620及Caco-2)与kras野生型结肠癌细胞株(HT29)中检出。其中共检测出35个磷酸化和非磷酸化蛋白质大于1.5倍变化。19个上调蛋白为：TNF-a, p-EGF Receptor (Tyr1068), ETS1, H-Ras, p-CREB (Ser133), p-PKCa (Ser657), β-catenin, p-p53(Ser392), Hsp90, Akt, Cdk6, PKCa, Cyclin E, Survivin,14-3-3β, Cdc2p34, ERK, p27和p-AKT (Ser473)。16个下调蛋白为：NFkB50, p14, Cdk2, E-cadherin, PTEN, Vimentin, p-HGF R/c-MET (Y1003), p-PKC a/βⅡ, Cdc42, p-Stat3(Ser727), p-eIF4B (Ser422), p-PKC delta (Thr505), p-p38(Thrl80/Tyr182), Notch4, ATF-1和Calretinin。3.16条主要改变的蛋白质信号传导通路参与微卫星不稳定型结直肠癌的调控,包含p53信号传导通路,PI3K/AKT信号传导通路,14-3-3β信号传导通路,ATM信号传导通路和HGF信号传导通路等。4.15条主要改变的蛋白质信号传导通路参与kras突变型结直肠癌的调控,包含HGF信号传导通路,14-3-3β信号传导通路,EGFR信号传导通路,PI3K/AKT信号传导通路和p53信号传导通路等。5.微卫星不稳定型结肠癌中细胞信号传导网络模型的构建。6.微卫星不稳定型结肠癌细胞株与kras突变的微卫星稳定型结肠癌细胞株对表皮生长因子受体信号通路的影响。在微卫星不稳定型结肠癌细胞株中Raf与14-3-3β受到抑制且表达下调,但p70S6K与p90RSK被磷酸化激活。其下游效应蛋白,如ERK1/2和CREB无明显变化。kras突变的微卫星稳定型结肠癌细胞株中Ras、ERK、14-3-3β和p-CERB上调,而Raf、p70S6k和p90RSk未发生改变。结论p53, NF-kB p65, p-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)和E-cadherin在微卫星不稳定型结肠癌的细胞信号传导网络模型中位于重要节点。p53(Ser392)和p-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)蛋白质作为在细胞信号网络中最为活跃的通路蛋白质肯定在微卫星不稳定型结直肠癌中扮演更重要的生物信息学角色。这个复杂的信号传导网络影响微卫星不稳定型结肠癌中的许多细胞功能,包括细胞周期、细胞凋亡及细胞存活等。可为寻找微卫星不稳定型结直肠癌的靶向治疗寻找新的理论依据。EGFR/RAF/MEK信号传导通路在kras突变的微卫星稳定型结肠癌细胞株中被特异性激活,可为kras突变的微卫星稳定型结肠癌探索潜在的治疗方案。