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研究背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是中老年人的常见的关节疾患,重要表现为关节软骨退变、磨损、骨质增生,导致关节肿胀、疼痛、畸形和功能障碍等,严重的影响人们的日常生活。骨关节炎的病理改变中,软骨细胞和软骨基质的改变占重要地位。瘦素是由白色脂肪组织分泌的一种激素,具有多种作用,近来的研究发现,瘦素受体在骨关节炎软骨细胞上表达,关节滑液内也发现瘦素存在,为了研究瘦素对软骨细胞的作用,探索瘦素在骨关节炎发病及发展中的地位,我们进行了本研究,希望能为临床防治骨关节炎提供参考。研究目的通过分离培养人类软骨细胞,进行下列研究:1.测定瘦素在不同人群软骨细胞中的表达量,从而确定瘦素是否与OA的发病相关。2.观察不同浓度瘦素对于软骨细胞增殖的作用,筛选出合适的药物浓度和作用时间。3.以瘦素刺激软骨细胞,提取总RNA,通过基因芯片技术比较瘦素对于软骨细胞基因的影响。4.根据基因芯片的筛选,在蛋白水平验证瘦素对于软骨细胞细胞因子表达的影响。5.观察瘦素对细胞凋亡的作用。研究方法1.人类软骨细胞的分离培养和鉴定:取手术中取出的软骨块,经机械分离、消化,使用组织贴块法体外培养软骨细胞,并经Ⅱ型胶原免疫组化染色,证实是否培养出软骨细胞。2.分别使用不同浓度的瘦素,加入软骨细胞培养基中,使用CCK-8和细胞计数法检测,观察不同时间点,不同浓度瘦素对于软骨细胞增殖的影响。3.选取对软骨细胞增殖影响明显的瘦素浓度,加入培养的软骨细胞中,使用试剂盒提取总RNA,并将提取的总RNA进行基因芯片比对分析,从而筛选出差异基因。4.选取相同浓度得瘦素加入培养的人软骨细胞,同时使用ELISA方法,在蛋白水平验证差异基因。5.使用流式细胞仪和电镜,检测瘦素对于软骨细胞凋亡和周期的影响。研究结果1.手术中取出的软骨组织,经机械分离和消化,贴块法培养出细胞,经Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性,证实是软骨细胞。2.体外培养OA组软骨细胞的瘦素表达明显高于正常人群组的软骨细胞,证实瘦素与OA的发病间存在着相关性。3.不同浓度的瘦素刺激软骨细胞,10ng/ml浓度的瘦素作用48小时对于软骨细胞增殖的抑制作用较为明显且平稳。4.经10ng/ml的瘦素处理48小时的细胞,RNA提取后进行基因比对,MMP、细胞骨架、TGF-β1、凋亡基因、胶原的表达均有差异,IGF-1的表达无明显差异。5.ELISA方法证实,在蛋白水平TGF-β1、IGF-1表达无明显差异,免疫组化半定量得出同样结果。6.流式细胞术和电镜证实瘦素能够促进软骨细胞凋亡,同时抑制细胞DNA合成。结论1.通过机械解离、消化及组织贴块培养出软骨细胞,为下一步关节软骨的研究奠定了良好的基础。2.瘦素在10ng/ml水平对于软骨细胞的增殖有抑制作用。而这一浓度正与骨关节炎时的关节液中瘦素水平相符,其在不同人群中抑制作用不同,其中可能存在正反馈机制。3.瘦素在10ng/ml浓度时,可以调节软骨细胞中包括MMP、细胞骨架、胶原、凋亡相关基因、TGF-β1、1GF-1等多种基因表达,并能够引起细胞凋亡的增加。4.瘦素在骨关节炎的发病及发展过程中,具有重要的调节作用。