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鸭疫里默氏杆菌是一种革兰氏阴性菌,能引起鸭及其他禽类传染性浆膜炎。该菌是一种非常重要的病原菌,阻碍着养殖业的发展。研究表明,鸭疫里默氏杆菌能利用血红素和血红蛋白作为其营养物质。目前,鸭疫里默氏杆菌血红素和血红蛋白的利用机制尚未见相关研究。我们发现鸭疫里默氏杆菌CH-1 B739-1417编码一个假定蛋白,其保守结构域属于HmuY-like蛋白家族,类似于已鉴定的牙龈卟啉单胞菌的血红载体蛋白HmuY。我们将该基因命名为hmuYRA,其蛋白为HmuYRA。本文拟探究HmuYRA蛋白是否参与到鸭疫里默氏杆菌血红素和血红蛋白的利用,研究HmuYRA蛋白的功能。研究结果如下:1鸭疫里默氏杆菌hmuY基因的克隆表达及多克隆抗体的制备经分析,在鸭疫里默氏杆菌中,hmuYRA基因与上游基因B739-1416位于同一个操纵子上。B739-1416编码一个TonB依赖性受体。我们以鸭疫里默氏杆菌CH-1基因组为模板,扩增出hmuYRA基因片段,将hmuYRA基因克隆到表达载体pBAD24上,再将质粒转入大肠杆菌JP313中,经阿拉伯糖诱导,表达出HmuYRA蛋白。用纯化的可溶性蛋白免疫昆明鼠,得到多克隆抗体。该抗体能识别鸭疫里默氏杆菌CH-1中的HmuYRA蛋白。2鸭疫里默氏杆菌hmuYRA基因缺失株及回补株的构建利用同源重组的方法,将氯霉素抗性基因插入到hmuYRA基因中间,达到hmuYRA基因缺失的效果。以CH-1基因组为模板,扩增hmuYRA基因左右同源臂;以CH-2型基因组为模板,扩增出氯霉素抗性片段。将以上三片段用PCR进行融合。再将该融合片段克隆到自杀质粒pEX18GM上,通过接合转移的方法将质粒转入RACH-1中,用抗生素的方法筛选出RACH-1ΔhmuYRA缺失株。将hmuYRA基因克隆到质粒pLMF03上,利用接合转移的方法将重组的回补质粒转入hmuYRA基因缺失株,成功构建回补株RACH-1ΔhmuYRA pLMF03::hmuYRA。3鸭疫里默氏杆菌HmuYRA蛋白的功能研究血红素结合试验表明重组的HmuYRA蛋白能以1:1的比例结合血红素,HmuYRA蛋白大多定位在细胞外膜上,在铁离子限制性环境下,HmuYRA蛋白也分泌到细胞外。基因的转录水平和蛋白表达水平均显示,hmuYRA基因的表达受到铁离子调控,不受血红素调控。hmuYRA基因的缺失严重影响细菌从血红蛋白中利用血红素。在大肠杆菌模型C600AhemApAM238::hasR中,HmuYRA蛋白对细菌利用血红蛋白没有明显影响,而对血红素的利用有明显抑制作用。吸光度试验及Dot-blot试验表明,HmuYRA蛋白能结合血红蛋白,但不能从血红蛋白中直接夺取血红素。