背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主要病理改变的系统性炎症性自身免疫病,全球发病率约为0.5-1.0%。我国大陆地区患病率约为0.42%,总患病人数约500万。目前,我国的RA治疗效果尚不理想,据估计有超过50%的中国RA患者,在诊断后没有经过规范治疗。作为一种常见的致残性疾病,本病的长期治疗及预后不佳,给患者家庭及社会带来沉重的经济负担。因此,迫切需要探求早期诊断、评估病情的生物标志物及有效的治疗靶点。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是特征性SOCS盒胞浆蛋白分子家族。SOCS是细胞因子信号传导的经典抑制剂,由SOCS1-7和CIS等8种成分组成。其中,SOCS1在免疫细胞的调节中发挥重要作用。SOCS1的SH2结构域可直接与激活的Janus激酶(JAKs)环结合,且通过其激酶抑制区域直接抑制JAK酪氨酸激酶活性。并且Janus激酶/信号传导和转录激活因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路是RA发病机制中公认的重要信号通路。因此,SOCS1可能参与了RA的发病过程,针对SOCS1参与的通路进行研究,可能为RA的治疗提供潜在的靶点。众所周知,编码基因的表达水平受到上游Micro RNA(miRNA)的调控,目前有文献证实miRNA的表达异常和RA的发生发展有着密切的联系,因此探索靶基因相关miRNA是研究靶基因的核心环节。miRNA是真核生物内源基因编码的18-25个核苷酸长单链非编码RNAs。在固有免疫及适应性免疫的信号转导过程中,miRNAs均起着重要的调节作用。目前报道的miRNAs,包括miR-146a、miR-155、miR-223等,可能参与了RA的发生发展过程。有报道显示,相对于骨性关节炎患者,RA外周血来源外周血单核细胞的miR-150-5p在RA患者中高表达。另有报道,注射间充质干细胞来源的miR-150-5p外泌体可降低胶原诱导关节炎小鼠的后脚掌厚度和临床关节炎评分。因而,miR-150-5p亦可能参与了RA的发病过程。既往研究显示,在系统性红斑狼疮中,miR-150-5p可通过作用于SOCS1,上调促纤维化蛋白,从而促进肾纤维化。说明miR-150-5p与SOCS1存在相互作用。两者的共同作用,是否参与了RA的发生发展,则需进一步明确。在RA患者关节中,RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)大量增加,导致滑膜增厚。同时RASFs可导致细胞外基质变性降解,进而侵蚀关节软骨和骨。因而在RA的发病过程中,RASFs是关键细胞之一。基于JAK-STAT通路,通过miR-150-5p靶向调控SOCS1的表达,影响RASFs的生物学功能,从而改善RA的预后,值得研究。如上所述miR-150-5p/SOCS1在RA中的作用,我们提出miR-150-5p和SOCS1可能作为诊断和评估RA的病情的生物标志物;miR-150-5p通过调控SOCS1的表达,进而影响JAK-STAT通路,从而改变RASFs的凋亡、增殖等生物学效应,最终影响RA的发生发展。为验证假设,本文进行了以下三方面的探索:第一部分,通过系统评价,探讨RA患者外周血SOCS1 m RNA的表达及其与RA的相关性。第二部分,通过病例对照研究,探索外周血白细胞(peripheral blood leukocyte,PBL)中SOCS1 m RNA、miR-150-5p在RA患者中的表达;二者对RA的诊断价值,及其与临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。第三部分,通过细胞实验,在RASFs细胞系MH7A细胞中,探讨miR-150-5p对SOCS1及JAK-STAT通路的作用,以及对MH7A细胞的生物学效应。第一部分外周血SOCS1 m RNA与RA相关性的系统评价目的:系统评价RA患者外周血SOCS1 m RNA与RA的相关性方法:计算机检索英文数据库:Pub Med、Embase、Web of Science、the Cochrane Library,及中文数据库:中国期刊全文数据库、中文科技期刊数据库、万方数据库、中国生物医学文献数据库。检索时限从建库至2019年10月。手工检索相关杂志,搜集国内外有关外周血来源的SOCS1 m RNA与RA相关性的研究,同时追踪纳入文献的参考文献。按照Newcastle-Ottawa Scale评价纳入文献质量,提取有效数据,用Revman 5.3进行Meta分析。用STATA12.0进行敏感性分析及发表偏倚分析。结果:共纳入4个研究,其中3个病例对照研究,1个队列研究。共307例样本,其中239例RA样本,68例健康对照者样本。结果显示:(1)与健康对照组比较,RA患者外周血T细胞的SOCS1 m RNA明显升高[WMD=1.98,95%CI(1.14,2.83),P<0.05];RA患者外周血单核/巨噬细胞的SOCS1 m RNA明显升高(P<0.05);RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的SOCS1 m RNA无明显升高[WMD=0.47,95%CI(-0.91,1.85),P>0.50]。(2)敏感性分析发现,Ortiz,A.M(2013)队列研究为异质性来源。剔除此项研究后,所有病例对照研究的亚组分析显示,与健康对照组比较,RA患者PBMC的SOCS1 m RNA明显升高[WMD=1.10,95%CI(0.51,1.68),P=0.0002]。(3)Begg漏斗图(P=0.089)或Egger回归检验(P=0.018)提示,可能存在发表偏倚。结论:SOCS1与RA可能存在一定的相关性。但结果估算的精确性,可能受样本量较小、发表偏倚等因素的影响。第二部分RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达及其临床意义目的:探讨RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达及其与RA临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。对象和方法:纳入自2018年5月至2018年12月,就诊于江西中医药大学附属医院风湿病科,符合RA分类标准的患者57例,同期选择19例年龄、性别等相匹配的健康体检者作为健康对照组。(1)测定所有受试者的血常规、肝功能、肾功能、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)等一般实验室资料。(2)采用聚合酶链式反应法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定所有受试者外周血miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达水平。(3)采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定所有受试者的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-21的相对表达水平。(4)评估RA患者的疾病活动度:疾病活动性评分(28-joint disease activity score,DAS 28)-ESR、DAS28-CRP、临床疾病活动指数(clinical disease activity index,CDAI)、简化疾病活动指数(simplified disease activity index,SDAI)。(5)统计分析RA组与健康对照组的miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达水平。并分析miR-150-5p、SOCS1 m RNA对RA的诊断价值,及其与疾病活动度、实验室指标的相关性。结果:(1)与健康对照组比较,RA组的miR-150-5p表达水平低,有统计学差异(4.61±0.17 vs 1.75±0.79,P<0.05);而SOCS1 m RNA表达水平升高,有统计学差异(9.18±0.38 vs 18.12±1.57,P<0.05);(2)与健康对照组比较,RA组的IL-6表达水平升高,有统计学差异(38.36±7.00 vs 57.91±32.64,P<0.05);而TNF-α、IL-21的表达水平无显著差异(P>0.05);(3)通过ROC曲线比较,根据Youden指数,RA患者PBL中miR-150-5p区分RA患者与健康人群的最佳界值为3.06(AUC=0.974,P<0.05);SOCS1m RNA无法区分RA患者(AUC=0.425,P>0.05);(4)miR-150-5p、SOCS1 m RNA的相对表达水平与ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-21、DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI等指标无明显相关性(P>0.05)。结论:RA患者PBL中miR-150-5p低表达,SOCS1 m RNA高表达。miR-150-5p可能是区分RA与健康人群的潜在生物标志物。第三部分miR-150-5p对RASFs生长和SOCS1表达的影响目的:miR-150-5p参与了免疫疾病的调控和发病,其具体机制尚不明确。本部分着重探讨miR-150-5p对RASFs细胞的生长,及对SOCS1和JAK2-STAT3通路的影响。方法:(1)设计与合成靶向结合SOCS1基因的miR-150-5p mimics和negative control mimics;(2)培养MH7A细胞,实验随机分为3组:正常对照(Normal control)组、NC mimics组,miR-150-5p mimics组;基于上述分组,miR-150-5p模拟剂(miR-150-5p mimics)、阴性对照模拟剂(negative control mimics,NC mimics)分别转染MH7A细胞。(3)双荧光素酶法验证miR-150-5p、SOCS1的靶向结合关系;(4)CCK8检测细胞活性;流式细胞学方法检测细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR测定miR-150-5p及SOCS1 m RNA的表达;Western Blot蛋白测定SOCS1、JAK2、p JAK2、STAT3、p STAT3等蛋白;ELISA测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6的表达水平。结果:(1)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组细胞凋亡率降低(28.877±1.241 vs 19.963±2.264,P<0.05)和S期细胞比例升高(13.780±6.878 vs 26.003±1.917,P<0.05);RASFs细胞增殖率升高(103.230±11.998 vs 130.751±22.702,P<0.05);(2)双荧光素酶报告基因分析结果显示,与NC mimis组比较,miR-150-5p mimics组的相对荧光强度明显下降,有统计学差异(25.462±1.006 vs 21.839±0.187,P<0.05);(3)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组SOCS1 m RNA的相对表达水平显著降低,有统计学差异(1.2401±0.164 vs 0.190±0.050,P<0.05);(4)与NC mimics组相比,miR-150-5p mimics组SOCS1蛋白的表达水平显著降低,有统计学差异(0.629±0.052 vs 0.459±0.028,P<0.05);miR-150-5p mimics组JAK2、p JAK2、STAT3、p STAT3等蛋白的表达水平无显著差异(P>0.05);(5)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组细胞培养基中的IL-6水平明显升高,有统计学差异(63.294±1.798 vs 132.570±5.886,P<0.05);对TNF-α的表达水平无明显影响(P>0.05)。结论:miR-150-5p可促进MH7A细胞的生长及IL-6的分泌,抑制SOCS1 m RNA的表达。提示miR-150-5p可能是RA治疗的新靶点。总之,本文将从荟萃分析研究、临床研究、细胞研究等多层面共同探讨miR-150-5p、SOCS1 m RNA在RA患者中的表达水平变化及其对RA的诊断价值和对疾病活动度、疾病严重程度的评估价值,并探索miR-150-5p靶向结合SOCS1对RASFs生物学功能的影响,以期为RA的诊治提供新的理论基础。