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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,致死率排名第二。据世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)2011年统计,全球每年新发乳腺癌病例138万例,每年由此而引发的死亡患者达到45.8万人,严重危害了人类尤其是女性的身心健康。乳腺癌晚期,肿瘤细胞常常会转移至肺部、骨髓等处,造成器官和组织损伤,成为乳腺癌患者致死的最主要原因。传统的手术治疗、放疗和化疗虽然可以在乳腺癌发病的早期有效地抑制肿瘤的恶化,但对于转移性的乳腺癌却不能有效治疗。因此开展乳腺癌发生、发展,尤其是乳腺癌转移的机制研究具有十分重要的理论意义,也将为乳腺癌治疗药物的研发奠定基础。核苷酸作为核酸合成的原料直接参与了基因的复制与翻译,同时还能够调控细胞的代谢和生理功能。同时胞外核苷酸还可作为细胞膜表面受体的激动剂,通过调节离子通道,激活下游信号通路,起到促进吞噬、诱导细胞因子分泌以及抵抗细胞凋亡等作用。而UDP作为胞外核酸的重要成员之一,能够特异性地激活G蛋白偶联受体P2Y6,参与调控平滑肌细胞的迁移,促进破骨细胞的骨吸收,抑制效应T细胞的活化,促进细胞因子分泌,招募免疫细胞等功能。近年来的研究发现,在组织损伤和肿瘤发生发展过程中,UDP等胞外核苷酸会作为一种危险信号从组织中大量释放,通过激活P2Y受体,参与调控肿瘤细胞的增殖。虽然陆续有一些文献报道了UDP及P2Y6相关信号通路在肿瘤发生、发展中的调控作用,然而到目前为止,其主要功能还是集中在对细胞增殖能力的调控,关于P2Y6受体对肿瘤细胞转移功能的调控研究还未见报道。因此,本论文拟通过免疫组织化学、RT-PCR和免疫印迹的方法对P2Y6在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达进行分析,初步探讨其与乳腺癌发生的相关性。然后通过shRNA的方法构建P2Y6稳定干扰的乳腺癌细胞株,并对其体外、体内的转移功能进行评价,探讨P2Y6受体对乳腺癌细胞转移的调控功能及作用机制。本论文主要分为以下四个部分：一.P2Y6受体在乳腺癌组织和细胞中的表达分析通过免疫组织化学染色,RT-PCR和免疫印迹等技术对多种乳腺癌组织、癌旁组织和乳腺癌细胞系中P2Y6受体的表达进行了检测。结果表明：相比癌旁组织,P2Y6在乳腺癌组织中的表达水平明显提高,且其表达丰度与乳腺癌的恶性程度呈正相关。通过对多种转移能力不同的乳腺癌细胞株中P2Y6的表达分析发现,P2Y6的表达在几种高转移性的乳腺癌细胞中明显上调,而对于转移能力较低的乳腺癌细胞株则表达较低。提示我们P2Y6受体可能在乳腺癌转移过程中发挥了十分重要的调控作用。二、P2Y6稳定干扰乳腺癌细胞株的构建。为深入研究P2Y6对于乳腺癌细胞转移功能的调控作用,我们采用RNA干扰技术,以人P2Y6基因为靶序列,设计sh-RNA干扰片段,构建了P2Y6基因干扰的慢病毒载体,并将其与辅助质粒包装成完整病毒,感染乳腺癌细胞,经筛选,得到稳定干扰P2Y6的乳腺癌细胞株。然后利用RT-PCR和免疫印迹法从mRNA和蛋白结果表明,shRNA干扰载体和P2Y6稳定干扰的乳腺癌细胞株构建成功。P2Y6表达水平相对于对照细胞组,P2Y6表达明显下降,为研究P2Y6如何调控乳腺癌细胞的迁移提供了实验材料。三、P2Y6稳定干扰细胞株的体外转移功能检测我们分别采用了划痕损伤、Transwell小室以及细胞浸润实验,在横向迁移、纵向迁移和细胞浸润方面对P2Y6受体干扰后的乳腺癌细胞的转移能力进行评价。实验结果表明,P2Y6受体干扰后,乳腺癌细胞的迁移和浸润能力明显降低,且对于UDP刺激的响应也显著下降,表明P2Y6受体可能通过UDP相关信号通路的激活参与乳腺癌转移的调控。为进一步研究P2Y6调控乳腺癌细胞转移的分子机制,我们还利用RT-PCR、Western blot、明胶酶谱等技术对MMP-9的表达及活性变化进行了检测,结果表明,P2Y6受体干扰后,MMP-9的表达在mRNA和蛋白水平均明显下调,且其降解细胞外基质的能力也显著降低。通过MMP-9特异性抑制剂阻断实验发现,MMP-9活性的降低能够明显阻碍UDP激活的细胞转移和浸润能力,提示我们P2Y6可能是通过MMP-9对乳腺癌细胞的转移进行调控。四、P2Y6稳定干扰细胞株的体内转移功能检测为全面评价P2Y6干扰后乳腺癌细胞的体内转移功能,我们采用荧光素酶报告基因系统对乳腺癌细胞在小鼠体内的转移进行活体分析。为此,我们首先对实验室已有的带荧光素酶基因的MDA-MB-231细胞株中P2Y6的表达进行稳定干扰,并将其注射到裸鼠左心室,进行乳腺癌细胞转移的体内活体观察,同时分别采用UDP和MRS2578对P2Y6相关信号通路进行激活和阻断,研究P2Y6及相关信号通路对于乳腺癌细胞转移的影响。结果表明：体内注射UDP组能够在一定程度上增加乳腺癌细胞的转移能力,而MRS2578则能够明显抑制这种转移。同时P2Y6受体表达的降低能够明显减少乳腺癌细胞的迁移能力,且UDP也不能促进该乳腺癌细胞株的进一步转移。说明P2Y6确实参与了乳腺癌细胞的体内转移过程,并有可能是通过UDP相关信号通路进行调控。综上所述,我们的研究表明,P2Y6的表达与乳腺癌的发生恶性程度有着密切的联系,P2Y6表达的降低能够明显降低乳腺癌细胞体内、体外的转移能力,并且这种作用可能是通过对MMP-9表达和活性的调控来实现的。