[背景]胃癌是世界上最常见的消化系统实体肿瘤之一。胃癌是我国恶性肿瘤中第二大常见的癌症,严重威胁人类的健康。约90%的胃癌表现为腺癌,主要起源于胃的腺体或粘膜[1]。迄今为止,关于胃癌的发病机制尚未完全清楚,研究其相关分子机制,对肿瘤的早期诊断、治疗以及评估其预后具有非比寻常的意义。几十年来,胃癌最有效、最彻底的治疗方法是手术治疗,其次是大量的放疗、化疗和新辅助治疗。虽然早期胃癌的5年生存率较高,胃癌细胞容易发生转移,大多数晚期胃癌患者失去了手术切除的机会,放疗或化疗反应不满意[2],这也是目前癌症难以治愈的主要且重要原因。不幸的是,由于缺乏有效的生物标志物,早期胃癌的检出率很低,因此大多数患者在诊断时已进展到晚期[3]。近年来,通过对靶向药物、肿瘤疫苗、单克隆抗体等新疗法的探索,延长了患者的生存期,提高了患者的生活质量[4]。同时,研究新的生物标志物将提高对胃癌的诊断和预后预测,为胃癌患者的临床治疗提供有力的工具。Ⅳ 型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)是一种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白,在所有基底膜(basement membrane,BM)中均有表达[5,6],由6条α链组成。众所周知,癌细胞可以突破BMs屏障,向远处侵袭且转移。作为BM的主要成分,其胶原网络在调节细胞黏附、迁移和分化方面发挥着重要作用[7]。Ⅳ型胶原网络可介导BM的降解和上皮细胞对基质的侵袭[7]。因此,Collagen Ⅳ蛋白功能或表达的异常可导致BM结构的不稳定,导致肿瘤的发生发展。Collagen Ⅳ已被证明在许多类型的肿瘤如胰腺癌和乳腺癌中过表达[8,9]。Collagen Ⅳ蛋白在肝转移手术切除患者中过表达[10-12]。进一步研究发现Collagen Ⅳ通过调节CCL5和CCL7的表达促进肝转移[13]。高表达的Collagen Ⅳ蛋白在髓系白血病中被证实促进细胞迁移和粘附[14]。另一项研究表明,肿瘤细胞来源的Collagen Ⅳ蛋白可以促进肿瘤细胞的扩散,增强细胞的侵袭能力[15]。此外,在三阴性乳腺癌中,Collagen Ⅳ蛋白的下调可显著抑制细胞增殖和侵袭[16]。Collagen Ⅳ蛋白与三阴性乳腺癌的预后具有相关性[17]。据报道,胰腺癌患者中循环中Collagen Ⅳ蛋白表达升高与易复发、生存差密切相关[10]。同样,最近的一项回顾性多中心研究表明,高水平的可溶性Ⅳ型胶原片段与结直肠癌患者的总体生存不利显著相关,这为预后提供了一个强有力的生物标志物[18]。一些相关证据表明,Collagen Ⅳ的快速粘附是口腔鳞癌发生的重要过程[19]。上述研究可能为人类癌症的治疗提供新的且有吸引力的治疗方法。然而,关于Collagen Ⅳ在胃癌中的预测和预后价值却知之甚少。Collagen Ⅳ对胃癌细胞具有怎样的生物学功能的影响研究也尚不足。本次研究通过免疫组织化学方法,采用组织芯片法检测正常和原发胃肿瘤组织中Collagen Ⅳ蛋白的表达。我们分析了肿瘤组织中Collagen Ⅳ蛋白表达与胃癌患者临床特征的相关性。除此也分析了临床病理特征、Collagen Ⅳ蛋白表达与患者预后总体生存期(overall survival,OS)的关系。在体外实验中证明胃癌细胞中高表达CollagenⅣα1,并验证了其生物学功能。[目的]Collagen Ⅳ是基底膜中最重要的结构成分。越来越多的研究表明,CollagenⅣ在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。因此,我们研究了胃癌患者Collagen Ⅳ表达与其预后的关系,以及Collagen Ⅳ α1蛋白对胃癌细胞株增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。[方法]为分析胃癌患者组织中Collagen Ⅳ的表达情况,采用免疫组织化学方法对100例肿瘤组织和80例癌旁正常组织进行组织芯片(Tissue microarray,TMA)分析。应用SPSS软件分析Collagen Ⅳ表达与生存、临床病理变量的关系。体外培养胃癌细胞株HGC-27,MKN-45,MGC-803,SGC-7901和正常人胃粘膜细胞株GES-1。Westen-Blot检测胃癌细胞株与正常胃粘膜细胞株的细胞中Collagen Ⅳ α1表达情况。在胃癌细胞株(选择两种细胞株)中干扰Collagen Ⅳ α1编码基因COL4A1,检测细胞中COL4A1表达水平。当细胞中COL4A1表达水平下降时(蛋白水平或mRNA水平下降),CCK-8检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞周期变化以及细胞凋亡,划痕实验及transwell检测细胞迁移侵袭能力变化。Westen-Blot检测凋亡相关蛋白(BCL-2,caspase3,PARP)活性形式变化。[结果](1)免疫组化显示:胃癌肿瘤组织中存在Collagen Ⅳ表达,且存在表达差异。(2)Collagen Ⅳ的表达高低与肿瘤浸润深度、淋巴转移以及临床分期有关。(3)患者的性别与患者的总生存时间无明显相关性,年龄、病理分期、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移、远处转移、临床分期以及Collagen Ⅳ表达均与预后不良有明显相关性(p<0.05)。(4)多因素分析表明Collagen Ⅳ表达高低,肿瘤大小以及是否有远处转移是胃癌患者预后不良的独立预测因素。(5)正常人胃粘膜细胞株GES-1和四种胃癌细胞株的Western Blot实验表明,胃癌细胞株MKN-45和SGC-7901中Collagen Ⅳ α1表达明显增强。(6)干扰 MKN-45 和 SGC-7901 细胞中 Collagen Ⅳ α1 编码基因 COL4A1 表达后,CCK-8结果显示:与对照组相比,两种细胞的增殖能力均明显下降(p<0.05)。(7)干扰MKN-45和SGC-7901细胞中COL4A1表达后,与对照组相比,其迁移距离显著较少,具有统计学意义(P<0.05);Transwell实验分析显示,与对照组相比,侵袭入小室的细胞显著减少,具有统计学意义(p<0.05)。(8)干扰MKN-45和SGC-7901细胞中COL4A1表达后,流式细胞技术分析显示,与对照组相比,其细胞凋亡明显增加,Western Blot显示凋亡蛋白表达水平增加,具有统计学意义(p<0.05)。(9)干扰COL4A1表达后,MKN-45和SGC-7901细胞的细胞周期受阻:流式细胞技术分析显示,干扰MKN-45和SGC-7901细胞中COL4A1表达后,与对照组相比,G1期细胞比例稍增加,S期细胞无明显变化,G2/M期细胞比例稍减少。[结论]Collagen Ⅳ在胃癌组织中存在高表达,且表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及临床分期具有相关性;且Collagen Ⅳ高表达是预后不良的独立预测因素。Collagen Ⅳ α1的高表达与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强,凋亡能力减少相关。