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研究目的:肝癌是一种临床常见的恶性肿瘤,全球50%的病人集中在我国。肝癌的病因复杂,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是中国肝癌的主要危险因素。2017年国际著名期刊《Science Translational Medicine》报道了台湾等地区肝癌高发与马兜铃酸（Aristolochic acid,AA）暴露有关,引起社会各界高度关注。AA是马兜铃科植物所含的共同成分,马兜铃科植物在中国广泛分布,我国仍有部分含AA的中草药材应用于临床。国内外研究已经明确AA具有肾毒性和泌尿系统致癌性,但从未把肝脏列为靶器官。基于以上背景,本研究旨在探讨AA暴露是否是肝癌的直接病因或诱因,阐述乙肝病毒感染与AA是否有协同作用,为肝癌的防控、马兜铃酸相关中药材的安全风险评估提供科学数据和政策依据。方法:本研究对临床多中心收集的772例肝癌样本进行马兜铃酸-DNA加合物检测,初步了解肝癌人群中AA的暴露情况;同时对51例HCC癌组织及对应癌旁组织进行全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）,获得HCC样本单核苷酸位点变异（single nucleotide variants,SNV）频谱及高频突变基因图谱,进一步分析HBV相关肝癌和非HBV相关肝癌样本的A>T突变率差异;利用TCGA公共数据库获取多种肿瘤的高通量测序数据,进行肿瘤预后相关基因的通路富集分析,以及绘制预后相关基因的相互作用网络。利用成年小鼠AA-I灌胃模型,观察AA-I对小鼠体重、总生存率以及小鼠各脏器肿瘤发生率的影响;通过对小鼠肝脏切片进行天狼星红染色,观察AA-I对肝脏纤维化的影响;在AA-I灌胃模型基础上,联合CCl4腹腔注射在体内构建肝纤维化模型,观察AA-I是否会进一步加重小鼠肝脏纤维化,比较AA-I在正常肝与肝纤维化背景下对肝癌发生的影响;通过对小鼠肝脏和前胃组织的WGS分析,获得各脏器A>T突变比例,检测AA-I多次灌胃后AA-DNA加合物在不同脏器中的累积量。引进M-Tg HBV转基因C57BL/6J小鼠和Tg HBV转基因BALB/c小鼠,同样给予AA-I灌胃,观察HBV是否影响AA-I对小鼠肝脏的纤维化、成瘤率、生存时间以及AA-DNA加合物检出,探究AA-I与HBV是否存在交互作用。通过向出生14天的C57小鼠腹腔注射AA-I以探究其对肝脏的遗传毒性,构建AA-I单次给药幼鼠模型观察AA-I是否会导致幼鼠发生肝癌。对单次AA-I给药模型的幼鼠肝脏进行测序,分析其中A>T突变率的情况;检测AA-I单次给药后幼鼠各脏器中AA-DNA加合物的累积情况,分析AA-I对雌雄幼鼠的作用是否存在差异。通过AA-I联合CCl4幼鼠模型观察联合CCl4是否促进肝癌发生,进一步探究AA-I与常用肝癌化学诱导剂之间的差异。结果:在临床多中心HCC样本中AA-DNA加合物阳性率仅4.27%。临床HCC样本测序后显示A>T突变率不高,HBV相关肝癌与非HBV相关肝癌的A>T突变比例没有显著性差异,其中TP53、CTNNB1、TTN、MUC4和MUC16等基因为肝癌中的高频突变。利用TCGA公共数据库发现T细胞受体信号通路相关基因与肿瘤预后良好有关,进一步分析免疫相关通路中富集的预后基因,发现ACTN4、PTK2及TNFRSF10B等基因与不良预后相关,NFKBIA、PRKCD和TOLLIP等与预后良好相关,这些基因可能成为免疫治疗潜在的生物靶点。在成年小鼠多次给药模型中肝脏不是AA-I的主要靶器官,AA-I对C57小鼠有显著的降体重作用,且高剂量AA-I可导致肝脏转氨酶升高。但是AA-I不会导致小鼠肝脏纤维化,且不会进一步加重CCl4造成的肝纤维化。成年小鼠的前胃是AA-I的主要致癌靶器官,AA-I不能直接诱导成年小鼠发生肝脏肿瘤,且AA-I联合CCl4不会增加肝癌的发生率。小鼠前胃肿瘤中有大量A>T突变,肝脏中AA-DNA加合物检出量很低。在两种Tg HBV转基因小鼠模型中均未发现AA-I与HBV存在协同致癌作用。AA-I对Tg HBV转基因小鼠的肝功能影响比野生型小,AA-I同样不会引起或加重Tg HBV转基因小鼠肝纤维化,Tg HBV转基因小鼠与WT小鼠的肝脏肿瘤总发生率没有显著统计学差异。对出生14天的幼鼠单次AA-I给药,可在诱癌16个月时观察到肝癌,且肝癌中存在大量A>T突变,但肾脏依然是AA-DNA加合物形成的主要器官;AA-I单次给药联合CCl4可在幼鼠模型中促进肝癌发生,AA-I在幼鼠模型中的致癌作用与DEN相当,此外AA-I的致癌作用随剂量的升高而增强。结论:本研究发现AA-DNA加合物在肝癌大样本中检出率较低,乙肝背景的肝癌样本中A>T突变比例不高,且HBV相关肝癌和非HBV相关肝癌样本中A>T突变率没有明显差异,初步表明马兜铃酸不是本组研究中肝癌发生的主要诱因。在成年小鼠模型中,AA-I不能直接诱导肝癌发生,且在转基因小鼠模型中HBV与AA-I对于肝癌的发生没有协同作用;但AA-I对处于增殖发育期的幼鼠肝脏有较强的致癌作用,因此该类人群仍应谨慎使用含AA的中药材。