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树蝴蝶(Lobaria Kurokauae Yoshim,LKY)是一种典型的地衣型真菌,子囊地衣类(Ascolichenes)茶渍目(Lecanorales)牛皮叶科(Stictaceae)肺衣属(Lobaria Hoffm)植物光肺衣、裂芽肺衣和网肺衣的干燥叶状地衣体,又名老龙皮、老龙七、肺衣等。研究表明地衣多糖具有较强的抗氧化及抗肿瘤活性、并且能增强机体的免疫力。树蝴蝶作为地衣资源,广泛分布在云南省内,药食两用在民间已有多年历史,但至今对树蝴蝶多糖的分离纯化、结构解析及其生物活性的研究仍较少,且不够系统全面。本课题展开了对树蝴蝶多糖的提取、分离纯化、结构鉴定以及生物活性等方面的系统研究。本文主要研究结果如下:考察超声波辅助提取树蝴蝶粗多糖,用单因素和响应面筛选并分析树蝴蝶粗多糖提取工艺中的最佳条件。响应面分析法优化工艺得到最佳工艺条件为:超声功率86.8W,超声时间15.9min,液料比26.6:1。在该条件下,树蝴蝶粗多糖的得率为4.48%。考虑到实际操作的局限性,将优化参数进行修正,即优化为超声功率为80W、超声时间为15min以及液料比为25:1,平行5次实验,结果得到树蝴蝶粗多糖的实际得率为4.37%。最佳工艺条件下提取的树蝴蝶糖液,经脱色、Sevage脱蛋白、醇沉、浓缩、烘干等步骤,得到粗多糖,呈深黄色。粗多糖经DEAE-52柱层析分离,透析处理后得到两种单一多糖LKY-I、LKY-Ⅱ和一种非单一多糖LKY-Ⅲ,质量分别占上样量的16.67%、28.33%、5.00%。多糖LKY-I、LKY-Ⅱ经Sephadex G-100柱层析洗脱后洗脱曲线为单一对称峰,且对应的GPC图谱峰分布均一,峰形对称,表明LKY-I与LKY-Ⅱ是单一多糖,重均分子量Mw分别为63127Da、122495Da,而LKY-Ⅲ为非单一多糖,重均分子量Mw为697243Da。理化性质分析,结果表明三种多糖均不含可溶性淀粉和核酸,LKY-I为棉絮状白色粉末,总糖含量为88.91%,糖醛酸含量为13.21%,含有极少量蛋白质;LKY-Ⅱ为棉絮状淡黄色粉末,总糖含量为74.05%,糖醛酸含量为15.12%,含有0.46%的蛋白质;LKY-Ⅲ为黄色棉絮状粉末,蛋白含量为0.91%,总糖含量为59.18%,糖醛酸含量为16.02%。对LKY-I及LKY-Ⅱ进行结构分析,结果表明LKY-I主要有由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,5种单糖的摩尔比是:1.1:2.0:46.5:28.5:20.5;LKY-Ⅱ主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖组成,且各单糖的摩尔比为1.2:1:1.5:60.9:12.8:22.5。红外光谱显示LKY-I及LKY-Ⅱ均为多糖类物质,均含有α-D-甘露糖。经高碘酸氧化、Smith降解、甲基化以及核磁结果分析可知,LKY-I中含有1→2,6、1→3、1→4、1→6四种糖苷键,且1→6糖苷键为主;LKY-Ⅱ含有1→2、1→2,6、1→3,6、1→4和1→6糖苷键,且1→6糖苷键为主;LKY-I及LKY-Ⅱ的吡喃糖构型分为α、β两种类型。刚果红实验及扫面电镜结果分析表明:LKY-I与LKY-Ⅱ不存在多股螺旋构象;两种多糖呈不规则的片状,棒状,团状等,且表面结合较为紧密,但集聚体整体性不强,说明LKY-I及LKY-Ⅱ均为无定型结构。采用多糖对DPPH、ABTS+自由基的清除能力及Fe3+的还原能力测定多糖的抗氧化活性。结果表明,各多糖样品在0.25~10mg/mL浓度范围内均具有一定的抗氧化活性,且与浓度呈正相关。对DPPH自由基的清除能力及Fe3+的还原能力,LKY-III均优于其他多糖样品;但对ABTS+的自由基的清除能力则LKY-I最强。树蝴蝶纯化多糖对人肝癌细胞HepG-2、人乳腺癌细胞MCF-7以及人非小细胞肺癌细胞HCC827均有较强的抑制作用,且与浓度呈正相关性。抗肿瘤活性结果表明,LKY-I抗肿瘤活性效果最佳,且与阳性对照5-Fu尿嘧啶相当,而LKY-Ⅱ及LKY-Ⅲ多糖次之,粗多糖LKY的抗肿瘤活性最弱。当树蝴蝶多糖单独作用于小鼠脾脏淋巴细胞时均可促进脾细胞增殖,但是促进程度较低;当树蝴蝶多糖协同LPS或ConA作用于脾淋巴细胞时,均可明显促进脾淋巴细胞的增殖,但是四种多糖之间没有的显著性差异。树蝴蝶多糖在125~500μg/mL浓度范围内,吞噬中性红的能力明显大于1μg/mL阳性对照组(LPS),且在设定浓度范围内作用显著(p<0.05),吞噬作用强度相似。在31.25~500μg/mL浓度范围内,树蝴蝶多糖均可促进巨噬细胞分泌NO、IL-6及TNF-α细胞因子,并且具有剂量依赖性。RT-PCR法检测多糖对巨噬细胞的i NOS、IL-6及TNF-α基因表达的影响,在125~500μg/mL浓度范围内,LKY-I可使iNOS、IIL-6及TNF-α的基因表达上调。总体来说,树蝴蝶纯化多糖具有较强的免疫调节活性,并且单一多糖LKY-I、LKY-Ⅱ的活性较强,非单一多糖LKY-Ⅲ的活性次之,粗多糖LKY较弱。