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中国是第一养猪大国,也是第一猪肉消费大国,随着消费者对猪肉品质要求的不断提高,优质猪肉的生产已成为养猪业亟待解决的重要问题。肌内脂肪是评价猪肉品质的一个重要指标,其与肉的嫩度、风味等肉品质性状有着密切的联系。肌内脂肪性状的遗传改良一直是猪遗传育种领域关注的重点,然而,长期以来利用常规育种技术进行猪肌内脂肪性状的遗传改良效果并不理想。因此,█鉴定影响肌内脂肪性状的关键基因,开发出有价值的分子标记,对开展肌内脂肪性状的早期、准确选育,对加快猪肌内脂肪性状的遗传改良进程及提高猪肉品质有着非常重要的意义。本研究利用全基因组重测序及转录组测序技术对影响猪肌内脂肪的变异位点及关键候选基因进行鉴定,其研究结果可为深入开展肌内脂肪形成的分子调控机制的研究,以及分子标记技术的研发奠定理论基础。1.利用全基因组重测序技术鉴定影响猪肌内脂肪的关键遗传变异位点本研究以1,310头皮杜长大四元杂交猪为研究群体,利用索氏抽提法对其背最长肌中肌内脂肪进行提取。从中选取极高或低肌内脂肪个体各30个,且它们之间肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)。对高组和低组的30个个体分别进行等量混池后构建了两个文库且在Hiseq2000平台进行全基因组测序。测序结果显示,高组和低组分别产生了 849,292,378和861,810,316个Clean Reads。通过与猪参考基因组比对结果显示,两个文库所测的reads在参考基因组上的比对率分别为75.56%和79.56%;此外,在参考基因组的覆盖度均为89.1 1%;而测序深度分别达到26.12×,25.66×。SNPs分析结果显示,高组和低组分别检测到了 2,038,236和2,021,681个SNPs;两个组中有74%的SNPs位于基因间区,而基因上的SNPs有94%位于内含子上。进一步分析显示,高组和低组中分别鉴定出242,010个和240,975个Indels,并且在基因组上的分布比例与SNP的比较相似。高低组中SNP在每条染色体的平均密度比较相似,而在不同的染色体之间存在差异,其中X号染色体的SNP平均密度最低。Indels在高低组中每条染色体的平均密度比较类似,然而Y染色体中差异较大。另外,高组与低组之间比较发现,存在17,184个影响肌内脂肪的候选SNPs,并且这些SNPs可注释到1,149个基因。GO分析结果显示,这些基因能够注释到三个类别,包括生物过程、细胞组分和分子功能,以及进一步分为49个子类;其中,注释到cell和cell part条目(term)中的基因数目最多。GO富集分析结果显示,在生物过程、细胞组成和分子功能分别富集到137个、18个及31个GO terms。而这些基因进行KEGG富集发现,总共能够显著富集到26个通路,包括PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)等。2.利用转录组测序技术鉴定影响猪肌内脂肪的候选基因本研究以279头皮杜长大四元杂交猪(饲养于11个组)为研究群体,利用索氏抽提法对其背最长肌的肌内脂肪含量进行测定,统计分析结果显示,肌内脂肪含量的最大值、最小值及平均值分别为6.56%、1.09%及2.64%。此外,肌内脂肪含量的SD值及变异系数也达到0.91和34.55%。本研究首先随机从11个组中选取3个组,并在每个组里分别选取3个极高和极低肌内脂肪个体(简称为H和L)分别组成一个混池测序文库,本研究共构建了 6个测序文库。表型统计结果表明,H和L组之间的肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)。测序结果显示,六个测序文库中总共获得了268,826,758 个 Clean Reads(每个样品的 Clean Reads 数目范围为 44,222,498-45,247,560个),共计 40.33 G clean bases;此外,Clean Reads 在 Raw Reads 中所占比率超过 90%。进一步通过与猪参考基因组比对分析结果显示,6个文库所获得的Clean Reads的平均比对率为65%左右。本研究中的6个测序文库中总共检测到了 13,568个新转录本,并且还分析得到了 16,798个表达的基因。差异表达基因分析结果显示,高、低肌内脂肪组之间鉴定出75个差异表达基因,其中包括28个上调和47个下调的基因。差异基因的GO富集分析结果显示,在生物过程、细胞组分和分子功能中分别有27、27和39个GO terms被显著富集,其中,FASN是一个影响肌内脂肪的重要候选基因,其被富集在 acyl-[acyl-carrier-protein]hydrolase activity 和 fatty acid synthase activity。差异表达基因KEGG富集分析显示,共有13条通路被显著富集,其中最显著的通路包括胰岛素信号通路和PPAR信号通路等;这些通路包括了SCD、PLIN1、PDK1和PRKAR2A等影响肌内脂肪的重要候选基因。3.候选基因PLIN1影响猪肌内脂肪含量的研究从279头皮杜长大四元杂交猪中选取极高或低肌内脂肪个体各30个,且它们之间肌内脂肪含量差异极显著。利用qRT-PCR技术检测高、低肌内脂肪组中的PLIN1 mRNA水平,结果显示,在高肌内脂肪含量个体中显著高于低肌内脂肪含量个体(n=30)。进一步检测了高低肌内脂肪组中PLIN1的蛋白水平,结果表明,高肌内脂肪组中PLIN1的蛋白表达水平显著高于低肌内脂肪含量组(n=6)。PLIN1在猪的脂肪组织极其高表达,肝脏组织低表达;而在其他的组织中几乎不表达。此外,PLIN1不论mRNA还是蛋白表达水平,与未分化的肌内前体脂肪细胞相比,脂肪细胞诱导分化后都是显著升高的。利用免疫组化检测PLIN1在猪背最长肌中的定位,结果显示,它被定位于肌纤维之间的脂肪细胞中,而在肌肉中没有定位到。此外,利用免疫荧光技术检测PLIN1蛋白在肌内脂肪细胞中的定位,结果表明它被定位在肌内脂肪细胞中的脂滴周围。利用siRNA技术对肌内脂肪细胞中PLIN1进行敲降的结果显示,siPLIN1组中PLIN1的mRNA和蛋白水平都显著低于对照组。当敲降PLIN1后,与对照组相比,肌内脂肪细胞中的甘油三酯水平显著减少。PLIN1敲降后明显观察到脂滴变小且小脂滴数量增多;此外,甘油三酯代谢相关基因GPAT1、DGAT1、ATGL及HSL基因没有发生显著变化,仅有FASN的mRNA和蛋白水平显著下降。4.候选基因FASN影响猪肌内脂肪含量的研究利用Western blot技术检测高、低肌内脂肪组中FASN的蛋白表达水平,结果表明,高肌内脂肪组中FASN蛋白表达水平显著高于低肌内脂肪组(n=3)。对60个个体(包括30个高肌内脂肪个体和30个低肌内脂肪个体)的FASN mRNA的水平进行检测发现,在高肌内脂肪组中FASN mRNA水平高于低肌内脂肪组。此外,FASN基因在脂肪组织中极其高表达,且在肌内脂肪细胞分化后表达水平增加。利用siRNA敲降技术能够显著下调FASN的mRNA和蛋白表达水平。利用EdU染色和流式细胞技术检测抑制FASN表达后肌内脂肪细胞的增殖和周期,结果显示,FASN基因敲降后肌内脂肪细胞增殖减少且细胞周期也发生明显的阻滞。此外,敲降FASN能够下调p-AKT的蛋白表达水平,而AKT的蛋白水平没有显著变化。SC79,一个AKT通路激活剂,当它处理肌内脂肪细胞时,能够显著上调p-AKT的蛋白表达水平。激活AKT通路能够挽救FASN敲降引起的肌内脂肪细胞的增殖抑制及周期阻滞。