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第一部分大鼠体内Oatp2表达状况及其年龄特征目的:探讨Oatp2在正常大鼠脑、肝组织内的表达及年龄因素对其表达的影响。方法:健康成年,生后20天,生后3天的Wistar大鼠各12只,雌雄各半。取脑、肝组织,免疫组化检测Oatp2蛋白的分布及表达,RT-PCR检测Oatp2-mRNA表达,比较年龄因素对Oatp2表达的影响。结果:(1)正常大鼠脑内Oatp2主要分布于脑微血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞及小脑神经元;(2)正常大鼠肝内Oatp2主要表达于肝细胞,以门静脉周围最为显著;(3)脑内Oatp2表达呈现随年龄增加表达下降趋势,而肝内Oatp2表达则随年龄增加而增加。结论:(1)正常大鼠脑、肝内均存在Oatp2表达,提示Oatp2在相应底物的体内过程中具有重要作用;(2)年龄是影响大鼠脑、肝内Oatp2表达的因素。第二部分痫性发作和AEDs对脑内Oatp2表达的影响目的:研究痫性发作及AEDs对大鼠脑内Oatp2表达的影响。方法:健康成年Wistar大鼠,经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发60min持续惊厥发作(60’SC),(1)在60’SC后6h-8w的6个不同时点上,采用免疫组化法检测Oatp2在脑、肝内的分布,Western blot和RT-PCR检测Oatp2蛋白及mRNA的表达水平,研究各时点Oatp2表达的动态变化;(2)选取60’SC后4w大鼠,分别予VPA(187.5mg/kg)、CBZ(125mg/kg)、PHT(62.5mg/kg)治疗4周后,采用免疫组化法检测大鼠脑、肝组织内Oatp2、P-gp的分布,western-blot及RT-PCR方法分别检测Oatp2、P-gp蛋白质及mRNA的表达水平。结果:(1)脑内P-gp主要分布于脑血管内皮细胞及脉络丛上皮细胞;(2)60’SC后各时点及AEDs治疗各组大鼠脑内Oatp2、P-gp仍主要表达于脑血管内皮细胞及脉络丛上皮细胞;(3)在60’SC后各时点的脑内Oatp2蛋白表达随时间延长而有下降趋势,以60’SC后8w最为显著(P<0.01);(4)慢性癫痫(60’SC后4w、8w)大鼠脑内存在Oatp2表达下降及P-gp表达增加,且变化程度与SRSs次数呈正相关;(5)各治疗组脑内Oatp2蛋白表达较正常对照组明显下降(P<0.05),而P-gp表达则较正常对照明显增加(P<0.05);(6)各组脑内P-gp蛋白表达与mRNA表达具有较好的一致性,而脑内Oatp2-mRNA表达无相应蛋白表达变化趋势。结论:(1)痫性发作和AEDs(VPA、CBZ、PHT)均可抑制脑内Oatp2表达,并诱导脑内P-gp表达增加,提示Oatp2在癫痫病理过程中可能存在与P-gp不同的作用;(2)脑内Oatp2蛋白的表达可能存在转录后调控因素,痫性发作和AEDs可能均是影响其基因表达及转录后调控的因子。第三部分Oatp2与AEDs关系的体外研究目的:以体外培养的BMECs作为BBB的体外模型,研究Oatp2对丙戊酸钠的转运作用,及丙戊酸钠等抗癫痫药对BMECs上Oatp2表达的影响方法:(1)贴块法培养并鉴定脑微血管内皮细胞,免疫细胞化学、Western blot法和RT-PCR法检测Oatp2及P-gp在BMECs上的表达;(2)研究10μg/ml～200μg/ml五个不同VPA浓度及2min～60min五个不同孵育时间对BMECs吸收VPA的影响;(3)研究Oatp2+/Oatp2-细胞(BMECs/成纤维细胞)对VPA的吸收;(4)研究Oatp2抑制剂(高浓度地高辛)对VPA吸收的影响;(5)给予不同浓度的VPA、PHT、CBZ持续作用于培养的BMECs,分别在给药后1w及4w用Western blot法检测细胞上Oatp2、P-gp蛋白表达情况。结果:(1)贴块法获得的BMECs呈多角形或铺路石形,单层贴壁生长。培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD34免疫荧光染色均为阳性,细胞纯度90%,且有Oatp2及P-gp表达;(2)BMECs对VPA的吸收具有时间依赖和浓度依赖的特点;(3)Oatp2+细胞(BMECs)对VPA的吸收较Oatp2-细胞(成纤维细胞)明显为高(P<0.01);(4)Oatp2抑制剂可显著抑制BMECs对VPA的吸收;(6)三种AEDs均可诱导BMECs上Oatp2表达减少,P-gp表达增加,其影响效应与剂量有关。结论:(1)贴块法可获得原代培养BMECs,方法简便易行,细胞纯度较高,且有转运体Oatp2及P-gp的表达,可作为血脑屏障上转运体的体外研究的模型;(2)BMECs上Oatp2可介导VPA的转运;(3)AEDs可诱导BMECs上Oatp2、P-gp表达变化。