过度的重金属锰(Mn)接触通常会诱发慢性神经中毒,产生帕金森样综合症状。该症发病机制复杂,目前临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此,迫切需要建立安全并有效的治疗锰诱导神经毒性的方案。对氨基水杨酸(PAS)自1959年以来作为二线药物在临床上被用于治疗结核病。最近的报道显示,在临床试验中PAS能有效缓解锰诱导的慢性神经中毒症状。然而,目前对PAS及其主要代谢物N-乙酰对氨基水杨酸(AcPAS)的脑内药物动力学特性尚不明确。本文采用体内外模型对PAS和AcPAS在大鼠脑内的药物动力学及ADME进行了研究,为两者的临床应用,以及研发治疗锰神经中毒的新药提供理论和实验依据。1.同时测定PAS及其主要代谢物的HPLC-荧光法的建立目的：建立快速、有效的分析方法以准确定量血浆、脑脊液(CSF)和脑组织中的PAS及其主要代谢物AcPAS。方法：生物样品经过蛋白质沉淀,上清液中各组分用C18柱通过流动相梯度洗脱分离,最后进行荧光检测,同时测定PAS和AcPAS的含量。结果：PAS,AcPAS和内标化合物在生物样本中的测定不受内源性物质干扰。空白血浆中PAS和AcPAS在0.05～500μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系,定量下限均为50ng/mL;脑组织匀浆和CSF中PAS和AcPAS在0.017～166.7μg/g浓度范围内呈良好的线性关系,定量下限均为17ng/g。生物样本中PAS和AcPAS的日内和日间精密度RSD%值在1-8%之间,准确性在93至109%之间。PAS在血浆和脑匀浆液中的绝对回收率分别为64-67%和67-69%,在CSF中绝对回收率为94-97%; AcPAS在血浆,脑组织和人工脑脊液的绝对回收率分别为65-66%,77-85%和94-97%。样品在长期储存,反复冻融过程中能保持稳定。结论：本研究建立了便捷而且有效的方法定量测定大鼠血浆、CSF和脑组织中的PAS和AcPAS.该方法灵敏度高、重复性好、能准确专属地定量分析生物样品中的药物。2.药物在脑内分布、组织蛋白结合和代谢研究目的：评价PAS和AcPAS从大鼠血液进入脑部不同区域的能力,为阐明其临床解毒机制和进一步开发利用提供科学依据。研究PAS和AcPAS与血浆和脑组织蛋白结合作用,以及PAS是否可能被分布于靶区域的N-乙酰转移酶1(NAT1)生物转化为AcPAS,预测影响PAS和AcPAS在大鼠脑部的吸收、分布和消除的可能因素。方法：雄性大鼠股动脉给予200mg/kg PAS,在45min的时间点采集CSF、血浆和各个脑区组织,以5-氨基水杨酸为内标,RP-HPLC测定给药后PAS和AcPAS在不同组织中的浓度。分离和纯化脑组织样品中疑似为代谢物的HPLC组份,并采用HPLC、1H NMR等方法鉴定了其结构为AcPAS.通过超滤离心法测定PAS和AcPAS在血浆和6个所选脑区的蛋白结合率。利用体外孵育法观察药物在脑部的代谢程度。结果：除脉络丛和CSF外,AcPAS在大部分测定脑区的浓度高于PAS,脑毛细血管壁中只能检测到AcPAS. PAS的浓度在脉络丛最高,其次为CSF,在丘脑中最低；AcPAS的浓度在脉络丛最高,其次为海马,在CSF中最低。血浆和脑组织中,超过90% PAS分子以游离形式存在,而非结合的AcPAS的比例在80-87%之间。大鼠脑内的NAT1在体外代谢孵育实验中不显示生物学活性,无法将PAS代谢生成AcPAS.结论：PAS给药45min后,PAS和AcPAS均能在脑内被检测到,且脑组织中AcPAS的含量高于PAS。PAS主要以游离的形式存在于血浆和脑组织中。较少部分AcPAS与脑组织蛋白结合。PAS给药后大鼠脑内的AcPAS来源于血液循环跨脑屏障吸收,而非在脑部代谢生成。3.对氨基水杨酸及其主要代谢物在大鼠体内的药物动力学研究目的：全面地揭示大鼠脑部不同区域对PAS和AcPAS的摄取程度和处置规律,获得PAS及AcPAS在脑中分布及脑内药物动力学性质。方法：利用已建立的HPLC-荧光法,评价大鼠股动脉注射PAS后母体药物及其代谢物的血浆药物动力学,脑脊液药物动力学和脑不同组织内药物动力学特征。PAS和AcPAS在大鼠体内不同体液或组织中的药物动力学参数通过DAS 2.0软件计算获得。结果：大鼠股动脉给予高剂量的PAS后,母体药物在血浆中的药物动力学符合二室模型,半衰期为34min。代谢物AcPAS在血浆达峰时间为86min。PAS在CSF中在17min达峰,并在4h内被基本消除。AcPAS在CSF中达峰时间为44min, PAS在血浆中的AUC0-∞值是AcPAS的3倍,在CSF中的AUC0-∞值是AcPAS的7.5倍。脉络丛中PAS和AcPA浓度相对较高,Cmax值分别为42.81±4.90μg/g和30.744±3.50μg/g。所测定的脑区域中,AcPAS的半衰期比PAS长。除脉络丛以外,AcPAS在各个脑区的AUC0-∞和Cmax值均高于PAS,提示代谢物透过脑屏障并进入脑不同区域的能力高于其母体化合物。结论：PAS与AcPAS显示不同的药物动力学特征,且单个化合物在血浆、CSF和脑不同区域的药物动力学行为也存在较大差异。由PAS和AcPAS的药物动力学-药效学相关性提示,AcPAS对螯合消除脑内锰离子起到了更为重要的作用。4.对氨基水杨酸及其主要代谢物体外转运研究目的：理解PAS及AcPAS在血脑屏障和血脑脊液屏障中可能的吸收和转运机制。方法：采用MDCK-MDR1细胞作为模拟血脑屏障药物吸收的体外模型；采用Z310细胞作为模拟血脑脊液屏障药物吸收的体外模型,应用二室Transwell(?)专运系统开展体外细胞转运实验,评价PAS及AcPAS在脑屏障的吸收转运,以及PAS对药物转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用。结果：PAS在MDCK及MDCK-MDR1细胞单层中的表观渗透系数均<1×106cm/s,提示其在血脑屏障透过较差。PAS在MDCK-MDR1细胞单层中的转运存在显著的外排现象,净外排率为3.8,且这种外排能被P-gp的经典抑制剂维拉帕米和奎尼丁抑制,且PAS能刺激MDCK-MDR1细胞囊膜上ATP酶的活性,证明PAS是P-gp的底物,提示P-gp是导致PAS在脑部含量较低的主要原因之一。AcPAS透过MDCK-MDR1细胞不受P-gp外排作用的影响。以罗丹明123(R123)作为P-gp的探针底物,证实PAS能影响MDCK-MDR1细胞单层中由P-gp介导的R123外排,半数抑制浓度IC50值为10.29μg/mL,提示PAS对P-gp有竞争性抑制作用。永生化脉络膜上皮Z310细胞的双室Transwell体外转运研究发现两种化合物在血脑脊液屏障的摄取或外排没有显著性差异,均倾向于从血液侧被摄取进入CSF侧。MRP1抑制剂MK-571能将AcPAS的外排效率抑制到阳性对照组的一半。结论：MDCK-MDR1细胞的体外转运研究结果显示PAS为P-gp的底物,高剂量的PAS使血脑屏障P-gp的转运作用达到饱和,是PAS在脑组织中急剧增加后被迅速消除的主要原因。AcPAS不是P-gp的底物,能够从血液侧透过血脑屏障进入脑实质组织间液,是AcPAS在脑组织中缓慢并稳定增加,且在所测定的各个脑区浓度较高的主要原因。Z310细胞的体外转运研究结果显示脉络膜上皮细胞上MRP1转运蛋白介导AcPAS由CSF向脉络丛外排,是AcPAS在CSF中浓度较低,但在脉络丛中浓度较高的主要原因。总之,大鼠股动脉给予PAS后,血液中的PAS能透过血脑脊液屏障进入CSF,进而从脑组织间液中被血脑屏障外排回血液。PAS代谢物AcPAS透过血脑屏障在脑内靶区域停留,最后可能从血脑脊液屏障被消除。从药物动力学-药效学相关性分析提示PAS和AcPAS似乎都能螯合并消除大鼠脑部靶区域中的重金属锰离子,达到解毒的目的,并且AcPAS对螯合消除脑内锰离子,可能起到了更为重要的作用。