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研究背景胃肠道原发性淋巴瘤占淋巴结外淋巴瘤的30-40%~[1],是淋巴结外淋巴瘤最常发生的部位,其中最常见的疾病类型是黏膜相关淋巴组织(Mucosa Associated Lymphoid Tissue,MALT)淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCL)~[2]。MALT淋巴瘤是低级别淋巴瘤,预后较好;DLBCL是高级别淋巴瘤,预后差,但是目前将胃肠道原发性DLBCL与淋巴结原发性DLBCL混淆,特别是其临床病理学特征、免疫分型,分子分型及预后相关因素等缺乏系统性研究。由于胃肠道原发性淋巴瘤发病部位的特殊性,其发生可能与胃肠道的局部微环境,如:幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染、慢性萎缩性胃炎、非特异慢性炎症、炎症性肠病和自身免疫性疾病相关,发病机制不同于淋巴结原发性淋巴瘤~[3]。但目前对于胃肠道原发性DLBCL的研究少,对其临床病理特征认识不足。近年来通过表观遗传学修饰的研究发现,果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(Enhancer of Zeste Homolog2,EZH2)是多梳抑制复合物2(Polycomb RepressiveComplex2,PRC2)的催化亚基,可以催化H3K27的三甲基化,使参与肿瘤发生的靶基因表达沉默[4]。EZH2的高表达和过度活跃与一些癌症的发病机制有关,包括前列腺癌,乳腺癌和子宫内膜癌~[5,6],并且EZH2的高表达和肿瘤的不良预后有关~[5,7]。EZH2在DLBCL的发生发展中起着重要作用~[8],在21.7%的生发中心型(Germinal Center B Cell,GCB)DLBCL患者中检测到EZH2 Y641突变~[9]。然而,在胃肠道原发性DLBCL中,EZH2蛋白表达和基因突变未见报道。目的1.(1)了解胃肠道原发性DLBCL患者的临床特征,包括乳酸脱氢酶(LacticDehydrogenase,LDH)水平、临床分期、国际预后指数(International PrognosticIndex,IPI)、治疗方式及预后等情况,并且了解胃肠道原发性DLBCL的组织学特征。(2)了解胃肠道原发性DLBCL患者EZH2蛋白表达水平及其与临床指标的关系。(3)了解胃肠道原发性DLBCL患者H3K27me3水平、B淋巴细胞瘤-2(B Cell Lymphonma Gene 2,BCL2)和c-MYC蛋白表达情况、Ki-67增殖指数、H.pylori感染情况以及和EZH2表达的关系。2.(1)探索胃肠道原发性DLBCL患者EZH2 Y641突变情况并比较其与普通淋巴结来源的DLBCL的差异;(2)了解胃肠道原发性DLBCL患者BCL2/Ig H基因融合情况以及c-MYC基因分离情况。方法1.(1)收集100例胃肠道原发性DLBCL患者的一般临床资料、包括LDH水平、临床分期、IPI指数、治疗方式等,并对患者进行随访,了解其预后等情况。之后对数据进行分析、归纳,总结出胃肠道原发性DLBCL患者的临床特点及其与预后的关系。(2)同时收集100例胃肠道原发性DLBCL患者的蜡块标本,对其进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,分析其组织学特征。(3)免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测EZH2、BCL2、c-MYC蛋白表达水平,检测H3K27me3水平、Ki-67增殖指数以及H.pylori感染情况。2.(1)提取100例胃肠道原发性DLBCL以及102例淋巴结原发性DLBCL石蜡组织DNA,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术扩增EZH2基因的16号外显子中包含Y641位点的片段,产物进行DNA电泳分析,纯化并进行Sanger测序。(2)荧光原位杂交(Fluorescence in Situ Hybridization,FISH)检测100例胃肠道原发性DLBCL患者BCL2/Ig H基因融合情况以及c-MYC基因分离情况。结果1.(1)患者通常表现为胃肠道病变的典型症状,与胃部的DLBCL相比,小肠和结直肠的DLBCL临床分期和IPI指数更高。(2)50.0%的病例表现为EZH2的高表达,高表达的EZH2与胃肠道原发性DLBCL患者的不良预后有关。(3)高水平的H3K27me3,BCL2阳性,c-MYC阳性,Ki-67高增殖指数的比率分别为48(48.0%),36(36.0%),11(11.0%),74(74.0%)。16例(16.0%)病人有BCL2/c-MYC双表达。EZH2高表达与高H3K27me3水平和c-MYC表达水平显著相关,但与BCL2表达和Ki-67增殖指数无关,在55例胃DLBCL病例中,20例(36.4%)为H.pylori感染阳性,H.pylori感染与较高的TNM分期有相关的趋势(P=0.056)。2.(1)在33例胃肠道原发性GCB-DLBCL中检测到了1例EZH2 Y641突变(3.0%,1/33),61例Non-GCB DLBCL没有检测到突变。我们还在淋巴结原发性GCB DLBCL中检测到9例(20.9%,9/43)EZH2 Y641突变,统计学分析显示胃肠道原发性DLBCL的EZH2 Y641频率显著低于淋巴结原发性DLBCL(P=0.022)。(2)分别在62例和59例病人中检测了t(14;18)(q32;q21)/Ig H-BCL2融合(6.5%,4/62)和c-MYC(5.1%,3/59)分离。BCL2基因易位仅发生在GCB DLBCL中(P=0.019)。没有检测到BCL2/c-MYC双重打击,BCL2与c-MYC蛋白表达与基因易位之间无相关性。结论:1.(1)胃肠道原发性DLBCL患者中高临床分期、高血清LDH水平、以及高IPI指数提示患者预后不良。不同发病部位的组织学分类之间没有明显差异。(2)高表达的EZH2与患者不良预后有关。(3)EZH2高表达与高H3K27me3水平和c-MYC表达水平显著相关。2.(1)胃肠道原发性DLBCL中EZH2 Y641的低频率突变说明胃肠道原发性DLBCL的病理特征可能不同于淋巴结原发性DLBCL。(2)胃肠道原发性DLBCL中t(14;18)(q32;q21)/Ig H-BCL2融合和c-MYC分离频率显著低于文献报道,这可能也是原发性胃肠道DLBCL的病理特征。