【摘 要】
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目的:将核酸适配体对靶物质的特异性以及胶体金比色法的直观性有机地结合起来,研究建立准确、特异检测动物性食品中氟苯尼考残留的快速方法,为保障食品安全和消费者健康提供可靠依据。方法:（1）氧化石墨烯-SELEX筛选氟苯尼考核酸适配体:构建一个全长80 bp,3’端和5’端固定、中间40 bp的随机文库,对制备氟苯尼考-ss DNA复合物条件进行优化,以经过离心、抽提、乙醇沉淀回收所得到的ss DNA为
【基金项目】
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新疆兵团科技局高新技术攻关项目,课题编号:2016AB014,项目名称:兽药残留和有害元素的检测及安全性评价技术研究；
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目的:将核酸适配体对靶物质的特异性以及胶体金比色法的直观性有机地结合起来,研究建立准确、特异检测动物性食品中氟苯尼考残留的快速方法,为保障食品安全和消费者健康提供可靠依据。方法:（1）氧化石墨烯-SELEX筛选氟苯尼考核酸适配体:构建一个全长80 bp,3’端和5’端固定、中间40 bp的随机文库,对制备氟苯尼考-ss DNA复合物条件进行优化,以经过离心、抽提、乙醇沉淀回收所得到的ss DNA为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素磁珠将PCR产物—双链DNA彻底裂解为单链DNA,作为次级核苷酸文库。每一轮的筛选完成都进行一次回收率计算,回收率变化较小则引入反筛物,以去除特异性差的核酸适配体;回收率达到饱和,筛选停止。（2）氟苯尼考核酸适配体的克隆和测序:经筛选后,将筛选得到的产物克隆、测序,进行同源性分析,并依据序列出现的频率、二级结构的稳定性以及亲缘性分析,进一步筛选得到候选核酸适配体序列;将候选核酸适配体进行亲和性分析,测定其解离常数Kd值,且将Kd值较小的候选核酸适配体用于特异性试验。选择特异性吸附能力更强的适配体序列作为氟苯尼考的特异性核酸适配体,用于建立核酸适配体比色法。（3）建立胶体金核酸适配体比色法,检测动物性食品中的氟苯尼考残留:优化胶体金核酸适配体结合的条件,在最优条件下建立氟苯尼考标准曲线,确定方法的最低检出限和方法的特异性。用建立的胶体金-核酸适配体比色法检测动物肝脏和动物肉样,并进行加标回收试验。同时,用ELISA试剂盒检测以上样品,比较两种快速方法的检测结果。结果:（1）以氟苯尼考为靶标,构建了长度为80 bp的寡聚核苷酸文库,中间含有40 bp随机序列,两端则为20 bp的固定序列作为引物结合位点;氧化石墨烯-SELEX法的优化参数是:氧化石墨烯溶液的浓度为5 mg/m L,氧化石墨烯溶液与ss DNA的质量比为400:1,氧化石墨烯与氟苯尼考共同孵育60 min。对人工合成得到的80个碱基长度的ss DNA文库进行了12轮的核酸适配体筛选,其中有10轮为正筛选,在第7轮和第11轮中引入了结构相似的其它抗生素进行反筛选,经过初步筛选得到了氟苯尼考核酸适配体。（2）经过对氟苯尼考核酸适配体测序分析,在第9轮得到30条不同序列,第12轮得到16条不同序列,发现第9轮和第12轮都来自4个不同的家族。最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37这8条候选适配体。亲和性分析试验中,解离常数Kd值在11.811 nmol/L～54.097 nmol/L之间,表明对靶标氟苯尼考核酸适配体都具有较强的亲和力。其中A26的Kd值为12.794 nmol/L,B18的Kd值为11.811 nmol/L;二者的解离常数值接近,且G含量均达到40%,进行特异性分析时选用A26和B18这两条候选适配体,两条适配体均对氟苯尼考有特异性吸附,且B18的特异性吸附更为明显。因此,B18序列作为氟苯尼考的特异性核酸适配体。（3）胶体金核酸适配体比色法最佳检测条件为:氯化钠浓度650 mmol/L、核酸适配体浓度2μmol/L、在520 nm处有唯一波峰的胶体金与氯化钠反应时间为10 min、核酸适配体与氟苯尼考反应时间为9 min、氟苯尼考与核酸适配体最优孵育时间为30 min。最优条件下,在0.1～800 ng/m L的氟苯尼考浓度范围内,吸光值与峰面积呈现良好的线性关系,线性回归方程为y=-7E-05x+0.6839,线性相关指数R2=0.9953,方法最低检出限为2.82μg/kg（n=7）。动物肝脏和肉样中氟苯尼考残留量为0.011 mg/kg-0.019 mg/kg,均未超过国家限量标准;样品加标回收率为80.49%～111.11%,且相对标准偏差值在合理范围内,表明本方法的重复性与精确性较好。与ELISA方法检测结果的相对标准偏差在0.3%～3.7%之间,表明本方法的一致性较好。因此,本方法可以用于快速检测动物性食品中氟苯尼考残留。结论:研究建立的胶体金核酸适配体比色法能方便、快捷、准确地检测动物性食品中氟苯尼考残留。
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