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在我国,随着肿瘤发病率和死亡率持续增加,恶性肿瘤已经成为人们的主要死亡原因,因此肿瘤成为我国的主要公共卫生问题。前列腺癌是泌尿及男生殖系统常见的恶性肿瘤之一,是老年男性常见的恶性肿瘤,95%以上的确诊病例年龄在45-89岁之间,平均年龄72岁。前列腺癌的发病率和死亡率因地区、人种而异,发病率最高为黑人,其次为美国白人,最低为东方人。但是,在我国,由于体检意识的增高及人口的老龄化,前列腺癌的发病率呈现出迅猛上升的趋势。前列腺癌的治疗包括手术、放疗、内分泌治疗、化疗及靶向治疗等综合治疗措施,早期前列腺癌患者通常预后良好,但仍有相当一部分前列腺癌患者在出现远处转移后才被诊断,导致预后不良。对于在分子水平上前列腺上皮如何转化为恶性肿瘤的研究在近年已取得了长足的进展,但也只是在近期才开始确定一些引起前列腺癌的致癌基因及抑癌基因。这些基因可能与前列腺癌的发生及发展相关,但其具体的作用机制及在前列腺癌发生发展过程中所起的作用尚无确切的结论。肿瘤发生及发展是多种因素共同作用的复杂过程,因此,对前列腺癌的研究要着重于探索及发现新的相关基因及其作用的分子途径,进一步找出潜在的治疗靶点,从而提高前列腺癌的早期诊断率及治疗效果,并对预后的判断提供新的分子标记。研究发现,钙蛋白酶(Calpain,CAPN)基因在人的正常生理过程和肿瘤发生发展中均起到重要调控作用。钙蛋白酶家族包含十余种亚型,CAPN 1和CAPN2的表达最为广泛,因而最受关注。研究证实CAPN在肝癌、胰腺癌、胆管癌、子宫内膜癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生与发展过程起着重要的调控作用。但到目前为止,CAPN2在前列腺癌发生及发展中的表达情况和作用机制尚不明确。本研究拟通过检测前列腺癌中CAPN2的表达,探究其在前列腺癌发生及发展中的作用,并进一步揭示其作用的分子机制,为前列腺癌的诊断和治疗提供新思路。第一部分CAPN2在前列腺癌中的表达及临床意义目的:探讨CAPN2基因在前列腺癌组织中的表达水平与相关临床病理学指标及患者预后的关系。方法:应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法和Western Blot法检测前列腺癌组织和相应的癌旁正常组织中CAPN2基因的表达水平。免疫组织化学方法检测前列腺癌组织中CAPN2的表达情况。统计分析CAPN2的表达水平与临床指标及预后的关系。结果:qRT-PCR检测和Western Blot检测结果均显示CAPN2基因在前列腺癌组织中的表达水平高于相应的癌旁前列腺组织(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明,相对于CAPN2低表达的患者,CAPN2高表达的前列腺癌患者的无生化复发生存时间更短(log-rank test,P<0.05)。前列腺癌患者中CAPN2表达水平与肿瘤远处转移和无生化复发生存率呈明显的相关性(P<0.05)。进一步的多变量分析表明,CAPN2表达水平和肿瘤病理分级是前列腺癌患者无生化复发生存率的独立的预后因素。结论:CAPN2在前列腺癌组织中高表达,CAPN2高水平表达与前列腺癌远处转移和无生化复发相关,并且是前列腺癌的独立危险因子。第二部分CAPN2对前列腺癌细胞功能的影响及其分子机制的研究目的:探讨前列腺癌细胞系中不同CAPN2表达水平对细胞增殖、侵袭、迁移以及细胞周期的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:运用慢病毒转染法,在人前列腺癌细胞系PC3、DU145、22RV1中分别构建CAPN2的敲低和过表达的细胞模型,并采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot方法检测转染效率。用CCK-8试剂盒检测敲低或者过表达CAPN2后细胞增的殖能力,并用细胞克隆实验进行验证。以Transwell法检测细胞的迁移及侵袭能力。PI染色流式细胞仪检测敲低或者过表达CAPN2后对细胞周期的影响。并通过检测MMP和AKT/mTOR信号通路中关键蛋白的表达及活性,探讨CAPN2参与前列腺癌发生及发展的可能的分子机制。结果:成功构建敲低shCAPN2,过表达CAPN2和阴性对照NC的稳转细胞株。稳转细胞用CCK-8染色检测细胞增殖能力,结果表明,与对照NC组比,过表达CAPN2细胞增殖能力明显增强(P<0.05),敲低shCAPN2细胞增殖能力降低(P<0.05)。细胞克隆实验进一步验证了此结果。迁移和侵袭实验结果表明与对照NC组比较,过表达CAPN2后前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.01),敲低CAPN2后前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力则明显减弱(P<0.05)。通过流式细胞仪检测细胞周期,结果显示与对照NC组相比较,敲低前列腺癌细胞PC3和DU145中的CAPN2表达,细胞周期G0/G1期比例显著增高,对应S期和G2/M期的比例明显下降(P<0.05),而过表达CAPN2细胞周期G0/G1期比例下降,对应S期和G2/M期比例则显著增加(P<0.05)。通过Western blot检测PC3、DU145和22RV1细胞中CAPN2表达改变后对相关蛋白表达水平的影响,结果表明,敲低CAPN2能够显著下调MMP9和MMP2蛋白的表达水平,过表达CAPN2能够显著上调MMP9和MMP2蛋白的表达水平,说明CAPN2可能通过调控MMP家族相关蛋白表达促进前列腺癌的迁移和侵袭能力。对AKT/mTOR通路关键蛋白表达水平的检测显示:在敲低CAPN2后的PC3和DU145细胞中,磷酸化的AKT和mTOR的表达水平显著降低;在过表达CAPN2后的22RV1细胞中,磷酸化的AKT和mTOR的表达水平显著升高,结果表明CAPN2可能通过参与AKT/mTOR信号通路促进前列腺癌细胞转移和增殖。结论:体外实验显示CAPN2能够影响前列腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期。并可能通过调控MMP家族相关蛋白的表达和CAPN2/pAKT/mTOR通路来调节前列腺癌细胞的生物学行为。