下调SHCBP1在鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移中的作用及机制研究

来源 :贵州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:allsky_
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目的:探究SHCBP1(Shc SH2-domain binding protein 1)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织和NPC细胞株中的表达情况,初步探究SCHBP1对鼻咽癌细胞迁移、侵袭能力及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响,初步分析其涉及信号通路。方法:从美国癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中获取头颈鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)m RNA表达数据,使用R语言程序包edge R分析差异基因;利用实时定量逆转录酶链聚合反应(quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR)技术检测SHCBP1基因在临床NPC组织及鼻咽部慢性炎症组织中m RNA的表达情况。细胞实验以高侵袭性人NPC细胞系5-8F作为研究对象,RT-q PCR检测5-8F和NP69中SHCBP1 m RNA表达情况。采用慢病毒载体干扰沉默技术构建慢病毒sh RNA-SHCBP1(LV-sh RNASHCBP1)载体,从而沉默NPC细胞中SHCBP1表达,并利用RT-q PCR技术检测干扰效率。设置慢病毒空载体sh RNA-NC(LV-sh RNA-NC)感染NPC细胞为阴性对照组(NC组),LV-sh RNA-NC组感染NPC细胞5-8F为实验组(sh RNA-SHCBP1组)。利用CCK-8法及集落克隆形成实验检测NPC细胞的增殖能力,随后利用划痕实验、Transwell迁移实验检测NPC细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验检测NPC细胞的侵袭能力,利用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E型钙粘蛋白(E-Cadherin)、N型钙粘蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Viminetine)、金属蛋白酶9(MMP9)以及经典Wnt通路相关蛋白Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)在NPC细胞中的表达情况。结果:(1)分析TCGA数据库显示SHCBP1在HNSC中表达量明显高于正常组(P<0.05);(2)RT-q PCR检测发现SHCBP1在NPC临床组织中的m RNA相对表达量(1.58±0.37)高于癌旁组织(0.53±0.19),在5-8F细胞中的m RNA相对表达量(1.75±0.27)也高于NP69细胞,其差异有统计学意义(P<0.05);(3)RT-q PCR及Western Blot均证实LV-sh RNA-SHCBP1能有效干扰5-8F细胞中SHCBP1的表达,组间差异有统计学意义(P<0.05),干扰效率约为91%;(3)CCK-8实验通过检测NC组在各个时间点吸光度:0h(0.17±0.02)、24h(0.30±0.01)、48h(0.68±0.08)、72h(1.35±0.10)、96h(2.44±0.15);SHCBP1-sh RNA组:0h(0.16±0.02)、24h(0.22±0.02)、48h(0.42±0.06)、72h(0.86±0.12)、96h(1.24±0.09),结果表明NC组在除0h外的各个时间点吸光度均高于SHCBP1-sh RNA组,克隆形成实验显示NC组克隆数(283.43±41.43)明显高于SHCBP1-sh RNA组克隆数(31.00±12.05),CCK8实验及克隆形成实验组间差异均有有统计学意义(P<0.05);(4)划痕实验证明NC组在12h(0.47±0.06)、24h(0.76±0.09)迁移率均大于SHCBP1-sh RNA组12h(0.17±0.01)、24h(0.27±0.05);Transwell迁移实验显示24h内NC细胞组迁移数量(218±20)高于SHCBP1-sh RNA组(60±11);Transwell侵袭显示24h内NC组细胞侵袭数量(160±16)高于SHCBP1-sh RNA组(42±11),组间差异均有统计学意义(P<0.05);(5)WB验证沉默SHCBP1后NPC细胞中,上皮标志蛋白E-Cadherin表达显著升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)、间质标志蛋白N-Cadherin、Vimentin表达的显著降低,组间差异有统计学意义(P<0.05),同时MMP9、Wnt3a、β-catenin表达降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)SHCBP1在NPC及NPC细胞株中高表达;(2)SHCBP1可增强NPC细胞增殖、迁移、侵袭能力。(3)SHCBP1可促进NPC细胞的EMT过程。(4)SHCBP1的促癌作用可能与NPC细胞中经典Wnt/β-catenin信号通路激活相关。
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