体内药物分析是药代动力学研究的基础。药代动力学研究中,由于药物受给药剂量、生物利用度、代谢转化等多种因素的影响,通常在生物样品中浓度低,杂质干扰大,因此需要高灵敏度和高专属性的分析方法研究药代动力学。LC-MSn技术特异性强,灵敏度高,可以多组分同时检测,已成为药代动力学研究中广泛使用的主要研究手段。随着LC-MSn的广泛应用,其应用的一些局限性也逐渐显现出来。如一些药物难电离而导致灵敏度差;一些有机小分子药物由于保留差,生物样品分析时,易受内源性物质的干扰而产生很强的基质抑制等。本文首先应用化学衍生化,改变LC-MSn难测定药物的化学结构而改变其物理和化学特性,再应用LC-MSn实现生物样品中难测定药物的定量测定。通过化学衍生化的方法,可以改善药物在LC-MSn检测中的色谱与质谱行为,从而达到提高检测灵敏度、降低生物基质内其他杂质的干扰和降低基质抑制的目的。另外,本文还将亲水作用色谱技术应用于生物样品中药物的定量分析,并将衍生化或/和亲水作用色谱技术与LC-MSn相结合,实现了一些生物样品中难测定药物的定量分析。本文将难测定药物按照官能团进行分类,包括酚羟基、醇羟基、酮和醛、羧基和胺基,每种官能团选择几个代表药物,研究衍生化反应。首先寻找有助于提高LC-MSn检测性能的衍生化试剂,同时要求衍生化试剂具有衍生化反应效率高、操作简单快速,定量生成稳定衍生物的特点。根据初步研究分别确定酚羟基的衍生化试剂为丹磺酰氯(Dansyl chloride,DNS-Cl);酮和醛的衍生化试剂为对甲基磺酰肼(Toluene sulfonyl hydrazine,TSH);羧基采用甲醇和乙醇为衍生化试剂;醇羟基衍生化试剂为甘油三甲基铵(Glycidyltrimethylammonium,GTMA);胺基衍生化试剂为氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC-Cl)。在确定衍生化试剂的前提下,对可能的影响因素进行考察,主要包括反应温度、时间、催化剂的种类和浓度、溶剂的种类和衍生化试剂的浓度等。并比较衍生化前后的色质谱行为的改变,评价衍生化反应对LC-MSn检测生物样品中含各官能团的代表药物的作用。①通过对DNS-Cl和含酚羟基代表药物KL-1、丹皮酚、咖啡酸(双羟基)和大黄酚(双羟基)的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应系统为乙腈系统;衍生温度为60 oC;衍生时间为10 - 15 min;缓冲盐pH为10 - 10.5;水相和有机相的比例约为1: 3 - 1: 5,依据药物的不同而不同。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加233;由于酚羟基不易电离,通过衍生化引入易电离的叔胺基团,可显著提高含酚羟基药物的离子化效率从而提高检测灵敏度。同时由于衍生化物非极性增大,色谱保留时间延长和色谱峰形改善。②通过对TSH和含酮基的孕二烯酮、米非司酮和丹皮酚的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应温度在40 oC - 60 oC之间,反应时间为≤8 h,催化剂三氟乙酸浓度在0.5 - 5 %之间时。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加168;由于反应生成更加易于质谱电离的腙,所以色谱行为主要表现为灵敏度提高。③通过甲醇或乙醇和含羧基代表药物L20051117、FS-3和SH-1(双羧基)的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应体系盐酸/甲醇和盐酸/乙醇比例均为1:9;反应的衍生温度为60 - 70 oC;衍生时间为20 - 40 min。甲基化质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加14,乙基化增加28。羧酸一般在ESI模式下检测灵敏度不高,在复杂生物基质中由于基质效应和高背景噪音,有时直接测定不能满足体内生物样品的检测灵敏度要求。当在药物的羧基上引入甲基或乙基后,可以通过增加药物检测的m/z和增加药物的保留时间,降低基质抑制和高背景噪音来提高质谱检测的灵敏度。④通过对GTMA和醇羟基代表药物伏格列波糖、半乳糖、D-木糖和葡萄糖的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:反应温度约为55 oC,反应时间≥4 h,衍生化试剂的浓度为50 %,催化剂浓度为1 N。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加116。同样,通过衍生化引入易电离的叔胺基团,可以显著提高单糖类药物的检测灵敏度,显著改善峰形和显著提高信噪比,使液质测定单糖类药物成为可能。⑤通过对FMOC-Cl和加巴喷丁的衍生化反应考察,确定衍生化反应较为通用的条件为:衍生化温度为40 oC;衍生化时间为20 - 40 min;缓冲盐的pH = 10。衍生化后,各药物衍生化产物的质谱准分子离子峰[M+1]+比原药物增加222;通过对小分子胺类药物的结构修饰,其衍生物非极性显著增大,保留时间显著延长,但是检测灵敏度未见提高。在上述研究基础上,分别建立了KL-1(酚羟基)、丹皮酚(酮基)、L20051117(羧基)、伏格列波糖(醇羟基)和加巴喷丁(胺基)等各官能团代表药物在生物样品中的衍生化LC-MSn联用定量测定方法,在完成方法系统验证的基础上,对实际的生物样品进行检测。研究结果表明,各个衍生化反应定量测定方法经过系统验证,均可满足实际生物样品中药物的PK/PD研究。对于未经衍生化难于测定的药物,通过衍生化,或显著提高了检测灵敏度,或显著增加了保留时间,或降低基质抑制和杂质干扰,而且衍生化后,峰形都有所改善,信噪比提高。另外,本文还应用新型的测定方法:HILIC-MSn实现对反相色谱难保留的胺基类药物的非衍生化方法的测定。以盐酸美金胺、加巴喷丁和盐酸特拉唑嗪为代表药物应用HILIC进行系统研究,结果表明,相比反相色谱,HILIC有以下三个优势:①在流动相中可以使用较高的有机相,有利于质谱检测灵敏度提高;②对极性化合物有很好的保留;③较低的基质抑制效应和杂质干扰。相比衍生化方法,可以避免前处理耗时长的问题。总之,衍生化LC-MSn联用的方法对于测定一些LC-MSn难测定的药物是十分有效的方法,该方法可以从根本上解决一些药物稳定性差、色谱保留差、杂质干扰大和检测灵敏度不高等问题。本文所选的衍生化反应效率高、操作简单快速,重复性好。各官能团的衍生化反应经过系统验证,可以满足生物样品中药物的定量测定。本文在系统验证的基础上,进一步研究了这些代表药物在生物体内的药代动力学。