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目的肝癌(hepatocelular carcinoma，HCC)，是我国最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后差，严重威胁着人类生命与健康。目前，手术切除仍是治疗肝癌首选和较有效的方法。化疗是肝癌一项重要的辅助治疗手段，但对正常细胞的毒性和肿瘤细胞的耐药性是化疗面临的两大难题。研究表明，Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，并具有抑制细胞凋亡和调节细胞周期双重功能，与肿瘤的化疗耐药性密切相关。纳米颗粒基因转运体是近年发展起来的一种新型的安全、有效并具有优良特性的非病毒基因转运载体。本研究：1．制备聚乳酸壳聚糖纳米粒，分析其性质和体外转染效率；2．利用新型的活细胞检测技术分子信标直接检测并证实人肝癌细胞系Bel7402高表达Survivin；3．利用聚乳酸壳聚糖纳米粒介导Survivin反义寡核苷酸研究增强阿霉素诱导肝癌细胞凋亡。方法1．采用乳化溶剂挥发法，优化工艺条件，成功制备粒径较小、分布均匀的PLA-CS纳米颗粒，用Malvern Zetasizer 3000E(Malvern，UK)检测PLA-CS纳米粒和PLA-CS／DNA复合物的Zeta电位以及粒径分布。使用原子力显微镜(Asylum Research MFP-3D AFMSystems)来检测PLA-CS纳米粒粒径大小和形态。然后利用电泳的方法观察PLA-CS NP与DNA的结合情况和对DNA的保护，MTT实验和流式细胞仪检测PLA-CS NP在体外细胞转染效率和细胞毒性；2．针对Survivin设计的分子信标通过PLA-CS纳米粒介导入正常肝细胞系HL7702细胞和肝癌细胞系Bel7402中，检测Survivin转录产物的差别，台盼兰实验检测分子信标对细胞的生长情况的影响，RT-PCR证实分子信标检测的准确性；3．通过PLA-CS纳米粒转染Survivin反义寡核苷酸进入肝癌细胞，运用RT-PCR和Western blot检测Survivin的变化，MTT检测细胞的增殖抑制，流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡率。用阿霉素处理后，MTT检测细胞的增殖抑制，流式细胞仪和AO／EB染色观测细胞的凋亡指数的变化。结果1．采用Malvern Zetasizer 3000E激光粒度分析仪进行粒径及分布的检测结果显示，制备PLA-CS NP的平均粒径值为87nm。粒径大小分布呈正态分布，分布均匀。原子力显微镜进行观测。纳米颗粒呈圆球形，表面平滑完整，分散良好，无粘附团聚现象。PLA-CS NP和DNA耦合后，其表面电位为＋10mV±1.5mV。从电泳的结果分析知，纳米粒和质粒DNA能有效的结合起来。MTT显示PLA-CS NP在低于3μg／μl浓度时，细胞生长的抑制率小于10％。流式细胞仪检测转染效率可达43.5％。2．分子信标经PLA-CS纳米粒转染细胞后发现正常的肝细胞系HL7702中几乎没有荧光信号；而肝癌细胞系中Bel7402细胞系内有较强的的绿色荧光信号。台盼兰实验显示细胞的活力基本未受影响。RT-PCR证实Bel7402细胞中Survivin mRNA表达高于HL7702细胞系。3．在转染了Survivin的反义寡核苷酸24小时后，反义寡核苷酸Survivin各组均显示mRNA和蛋白的表达下调，以800ng／ml组最为明显，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；MTT发现Survivin ASODN处理后各组细胞增殖活性均有不同程度降低；流式细胞仪检测发现Bel7402细胞在400ng／ml，600ng／ml，800ng／ml组的ASODN在作用24小时后凋亡率可分别为7.88±0.15％，14.16±0.35％，32.73±0.78％，与对照空白组0.50±0.06％和SODN转染组0.57±0.09％比较有显著性差异(P＜0.05)。在加用阿霉素后，600ng／mlASODN组的细胞凋亡率可达40.34±0.78％，与单独使用ADM和转染ASODN后的凋亡率16.94±0.54％和15.07±0.35％比较有显著性差异。在AO／EB染色中也可以发现ADM＋ASODN组内的比较多的细胞则发生了核固缩，浓染，破裂，出现了细胞凋亡的核形态变化，而MTT实验显示空白对照组与ADM组和ASODN组在转染细胞24小时后，细胞增殖抑制有明显的差异(P＜0.05)，而ADM＋ASODN组与其余三组比较均有显著性差异(P＜0.05)。结论1．成功制备平均粒径87nm、分布均匀的PLA-CS纳米颗粒。用壳聚糖修饰该纳米颗粒表面，使其带正电荷从而可逆的结合质粒DNA，组装成PLA-CS纳米颗粒基因转运体系，并对细胞生长毒性低。转染效率较高。2．利用分子信标建立了一种能在单细胞水平上检测活体细胞中基因转录产物的方法，有望发展成为一种能早期检测肿瘤标志物的方法。3．采用PLA-CS纳米基因载体介导转染针对Survivin设计的ASODN，转染效率较高，ASODN发挥了高效的封闭作用，PLA-CS纳米基因载体是一种安全，高效的新型的纳米基因载体。采用PLA-CS纳米基因载体介导转染SurvivinASODN,能有效的封闭Survivin基因，下调Survivin蛋白及mRNA的表达，并促进Bel7402细胞的凋亡。采用ASODN封闭Survivin的表达确实有效地抑制肝癌细胞的生长，增加细胞的凋亡。从而增加ADM的化疗敏感性，改善常规化疗的效果，具有临床应用的潜能。