【摘 要】
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目的1、通过检测小鼠口腔鳞癌淋巴道转移模型不同时期及不同器官（淋巴结,骨髓）微环境中CD8+T细胞、CD28+T细胞、髓源性抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSC cells）数量的变化,初步探究不同微环境下CD8+T、CD28+T、MDSC（CD11b+,Gr-1+）细胞对口腔癌淋巴道转移的靶向性影响及其作用机制。2、构建Balb/c小鼠口腔鳞癌淋
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目的1、通过检测小鼠口腔鳞癌淋巴道转移模型不同时期及不同器官（淋巴结,骨髓）微环境中CD8+T细胞、CD28+T细胞、髓源性抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSC cells）数量的变化,初步探究不同微环境下CD8+T、CD28+T、MDSC（CD11b+,Gr-1+）细胞对口腔癌淋巴道转移的靶向性影响及其作用机制。2、构建Balb/c小鼠口腔鳞癌淋巴道转移模型原发灶鳞癌细胞株。方法:1、4NQO饮水法构建Balb/c小鼠口腔鳞癌淋巴道转移模型,a.正常对照组（Normal）（n=10）:饮用自来水;b.阴性对照组（8 Weeks,舌部黏膜尚未出现病理改变,但已经存在4NQO药物影响）（n=10）:4NQO喂药后8周。c.中重度异常增生组（Dysplasia）（n=10）:4NQO喂药后20周;d.原发口腔癌组（OSCC）（n=10）:4NQO喂药后24周;e.原发口腔癌组（OSCC）（n=10）:4NQO喂药后28周f.颌下淋巴结转移组（Metastasis）（n=10）:4NQO喂药后第32周g.颌下淋巴结转移组（Metastasis）（n=10）:4NQO喂药后第36周h.颌下淋巴结转移组（Metastasis）（n=10）:4NQO喂药后第40周。收集以上各组小鼠的淋巴结及骨髓组织。流式细胞术检测不同时期、不同微环境（淋巴结、骨髓）中免疫细胞（CD8+T细胞、CD28+T细胞、MDSC细胞）数量变化情况。2、收集Balb/c小鼠口腔鳞癌模型舌部鳞癌组织,酶消化法及无血清培养原发灶细胞。相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态及其超微结构。对其表面标记（Pan-CK、S100、P75等）、裸鼠成瘤及细胞核型等进行检测并绘制生长曲线。结果:1、流式细胞术检测结果显示,（1）在淋巴结及骨髓中,从喂药后第8周至第40周,除了CD28+T细胞数量在喂药后第20周和第24周略低于正常对照组,其余相应时期CD8+T及CD28+T、CD11b+和Gr-1+细胞数量均高于正常对照组,差异有统计学意义。（2）不同时期淋巴结微环境和骨髓微环境的比较,除CD28+T细胞24周时在淋巴结中数量低于骨髓,相应的时期,CD8+T、CD28+T、CD11b+和Gr-1+细胞数量在淋巴的数量均高于骨髓,差异有统计学意义。（3）在骨髓组织中,CD8+T和CD28+T细胞数量的趋势为喂药后第8周至第24周上升,于第24周达到峰值,第28周开始缓慢下降,直至第40周,但仍处于平台期;在淋巴结组织中,CD8+T和CD28+T细胞数量在喂药后第8周至第24周呈下降的趋势,CD8+T细胞24-40周为上升趋势,而CD28+T细胞在24-32周上升,之后呈下降趋势,差异有统计学意义。（4）在淋巴结及骨髓中,CD11b+和Gr-1+细胞数量从喂药第8至第40周,随时间呈升高趋势,不同时间段比较差异均有统计学意义。2、采用Dispase Ⅱ胰酶消化联合无血清培养的条件,Balb/c小鼠口腔鳞癌原发灶细胞培养存活率可达90%,已稳定传至40代。免疫组化结果显示Pan-CK表达呈强阳性。结论:1.在用4NOQ对Balb/c小鼠化学诱癌直至淋巴道转移过程中,CD8+T和CD28+T以及MDSC细胞（CD11b+和Gr-1+）在小鼠淋巴结和骨髓组织中明显升高,提示微环境中免疫功能发生了改变,这可能与DTC的发生以及转移癌生成有关。2.CD8+T和CD28+T以及MDSC细胞（CD11b+和Gr-1+）在Balb/c小鼠淋巴结中的表达高于骨髓,这种表达的差异可能是口腔癌淋巴道转移靶向性的原因。3.在淋巴结中,从口腔癌的发生发展直至转移的过程中,MDSC细胞数量升高所致的逐渐上升的免疫抑制作用,以及CD28+T细胞数量在转移期的下降导致的免疫功能下降,对原发灶淋巴道转移的发生起了重要的作用;另一方面,CD8+T细胞的持续升高贯穿口腔癌的整个过程,因此推测CD8+T细胞的表达增高,可能与淋巴道转移无关。综上,将MDSC作为抑制口腔癌淋巴道转移的靶点可能更有效。4.Dispase Ⅱ胰酶消化联合无血清培养条件,可成功分离、纯化并稳定体外扩增Balb/c小鼠口腔鳞癌细胞,目前已达40代。
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