论文部分内容阅读
目的索拉非尼（Sorafenib）是临床治疗原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）的一线药物,但也仅能给晚期肝癌患者增加2-3个月的生存期。部分患者对索拉非尼呈现出先天耐药性或在治疗疗程中发展为获得性耐药。因此,寻找索拉非尼治疗肝癌的预测标志物,提高肝癌患者的个人化精准治疗,具有重要的意义。机制上,除了拥有抗肿瘤新生血管形成作用,索拉非尼还能够增强细胞内的脂质过氧化程度,诱导细胞发生铁死亡。而长链脂酰辅酶A合成酶4（acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4）参与细胞内的脂质代谢过程,能够促进铁死亡的进程。本课题拟探讨ACSL4对索拉非尼导致肝癌细胞死亡的机制和在肝癌患者肝癌组织ACSL4的表达对索拉非尼疗效的预测作用。方法首先,在体外实验中研究ACSL4蛋白表达量与不同肝癌细胞对索拉非尼敏感性之间的联系,其次,在裸鼠移植瘤实验中加强验证,最后,结合原发性肝癌患者的临床样本中ACSL4表达量与预后情况,对ACSL4蛋白在索拉非尼抗癌效应中的作用进行研究。1.体外细胞实验部分:（1）通过流式细胞术检测凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）,坏死性凋亡抑制剂（Necrostatin-1）,铁死亡抑制剂（Liproxstatin-1）等不同的死亡抑制剂对索拉非尼致肝癌细胞死亡的影响,确定索拉非尼所诱导的细胞死亡形式。（2）通过蛋白印迹法检测不同肝癌细胞系中ACSLs亚体的表达量。（3）分析肝癌细胞系的ACSL4表达量与索拉非尼的IC50的关联性。（4）通过蛋白免疫印迹法探究索拉非尼对肝癌细胞系中ACSL4表达的影响。（5）通过流式定量的方法检测ACSL4特异性抑制剂（如Rosiglitazone,Pioglitazone）对索拉非尼处理的肝癌细胞的保护作用。（6）应用si RNA技术构建Huh7细胞株ACSL4敲低模型,使用CRISPR/Cas9双载体病毒构建Huh7细胞ACSL4敲除的沉默稳转细胞株,通过观察转染后的细胞株在索拉非尼作用下的细胞死亡情况和克隆形成情况,进一步探讨ACSL4蛋白含量对药物诱导的细胞死亡的影响。（7）检测铁死亡诱导剂Erastin,RSL3以及BSO对ACSL4沉默细胞的影响,探讨ACSL4在细胞铁死亡中与索拉非尼诱导的细胞死亡中发挥作用的一致性。（8）使用BODIPY?581/591 C11和CM-H2DCFDA探针检测Huh7细胞与ACSL4沉默细胞在索拉非尼作用下细胞内的脂质过氧化情况,同时检测各细胞内GSH和MDA的含量,探究ACSL4对脂质过氧化的影响,以此寻找ACSL4在索拉非尼诱导的铁死亡所发挥的作用机制。2.裸鼠移植瘤实验部分:将接种阴性对照细胞或ACSL4沉默的Huh7细胞的32只6-8周龄雄性裸鼠分为四组:1)阴性对照细胞+PBS治疗组;2)阴性对照细胞+索拉非尼治疗组,3)ACSL4沉默细胞+PBS治疗组;和4)ACSL4沉默细胞+索拉非尼治疗组。待肿瘤生长到20-40立方毫米大小后,分别给予索拉非尼（30 mg/kg）或PBS（同等体积）隔日灌胃治疗。每天用卡尺测量肿瘤体积,用公式（长×宽×宽）/2计算肿瘤体积。两周后人道处死小鼠并收集肿瘤样本,测量肿瘤各种指标（包括MDA的含量）,以此研究ACSL4基因在体内实验中对索拉非尼抗癌药效的影响。3.临床样本实验部分:（1）在广西医科大学第一附属医院的HCC队列中,收集原发性肝癌患者病例临床信息和手术后组织样本。入组标准:（1）首选治疗是手术,然后经3个月的索拉非尼辅助治疗;（2）手术后留有组织蜡块;（3）索拉非尼治疗后有影像学评价,并可以按实体肿瘤的疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST Version 1.1）进行分级。共入组29名患者。（2）通过蛋白免疫印迹法检测样本中ACSL4蛋白的表达量。（3）收集接受索拉非尼治疗的原发性肝癌患者的肝癌组织和癌旁正常肝组织蜡块切片,通过免疫组化的方法,检测样本中ACSL4的表达量。（4）结合患者预后结果比较分析肿瘤组织中ACSL4表达量与患者预后的关联。结果（1）细胞死亡实验显示:凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）和坏死性凋亡抑制剂（Nercrostain-1）预处理,对索拉非尼组导致的Huh7细胞死亡（细胞死亡率为:51.77±4.20%）并无保护作用（P>0.05）。但铁死亡抑制剂干预组Liproxstatin-1、Ferrostatin-1、Deferoxamine、GSH-MEE的细胞死亡率分别下降至22.75±0.67%,27.16±0.28%,23.68±1.95%,24.45±1.05%（所有p<0.05）。（2）比较不同的肝癌细胞株,发现肝癌细胞的ACSL4蛋白表达量与索拉非尼在该细胞中的IC50呈现显著的反比关系（R=-0.952,P<0.001）。（3）在沉默了ACSL4的Huh7细胞中给予索拉非尼处理后,发现与NC-si组细胞死亡率（53.00±4.00%）相比,ACSL4-si1和ACSL4-si2细胞（瞬时转染细胞）死亡率较低,分别下降至22.61±3.76%,25.28±5.59%;与NC-sg组细胞死亡率（50.09±1.34%）相比,ACSL4-sg1和ACSL4-sg2细胞（稳定转染细胞）死亡率较低,分别下降至24.61±0.78%,30.78%±6.12%（所有P<0.05）。与未干预组（DMSO）细胞死亡率（57.00±1.33%）相比,经ACSL4特异性抑制剂Rosiglitazone、Pioglitazone、2,4-TZD处理后,索拉非尼诱导的细胞死亡率分别下降至34.34±4.49%,34.43±1.93%,40.63±1.73%（所有P<0.05）,提示抑制ACSL4可以减少索拉非尼诱导的细胞死亡。（4）在使用铁死亡诱导剂（Erastin,RSL3,BSO）处理Huh7细胞时发现,与NC-sg组相比,ACSL4-sg1和ACSL4-sg2组的细胞死亡率下降（P<0.05）,提示抑制ACSL4可以减少Huh7细胞的铁死亡。（5）在索拉非尼作用下,与对照细胞相比,ACSL4沉默细胞的脂质过氧化程度更低。（6）在裸鼠移植瘤实验中,对照组经索拉非尼处理后肿瘤体积增长的速度减缓;而ACSL4沉默的肿瘤对索拉非尼更为耐受,其形成的肿瘤和没有索拉非尼治疗组的肿瘤大小相近,而且出现更少的肿瘤组织坏死。Ki-67免疫组化的结果显示ACSL4沉默消除了索拉非尼治疗导致的肿瘤组织细胞增殖能力下降。（7）ACSL4在原发性肝癌患者的肝癌组织中高表达（P=0.000118）;在接受索拉非尼治疗的29名原发性肝癌患者中,ACSL4表达高的患者与ACSL4表达低患者的预后良好率分别为66.7%,23.5%,两者差异具有统计学意义（P=0.029）。结论:（1）索拉非尼诱导肝癌细胞发生铁死亡。（2）抑制ACSL4基因可以降低索拉非尼诱导的脂质过氧化程度,使Huh7细胞耐受铁死亡。（3）肝癌组织中ACSL4高表达提示索拉非尼治疗的原发性肝癌患者的良好预后。