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研究背景：近年来研究发现高血压及高血压肾病的发病率呈现逐年上升的趋势,目前减轻高血压已被列入终末期肾病治疗的主要方法。肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统是人体血压调节的主要系统,在慢性肾损伤特别是高血压肾脏损伤中有着极为重要的作用和意义。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为RASS系统中的重要活性介质,不仅通过产生血流动力学效应调节血压,同时在肾脏病领域中,也发挥着重要的致病作用。AngⅡ主要通过与两类G蛋白偶联受体AT1及AT2结合,激活不同的信号转导通路来发挥其不同的药理学作用。在此两种受体中,AT1受体介导AngⅡ的主要功能,该受体激活后可以诱发一些信号转导路径的激活,如增加细胞内钙离子浓度,以及激活细胞质磷脂酶A2 (cPLA2),有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK),蛋白激酶C (PKC)等,而这些信号转导途径对前列腺素的合成有着至关重要的作用。更有研究显示,抑制一个或多个前列腺素受体的活性可以有效的治疗高血压,至少有一种前列腺素E2受体在RAAS系统调节血压的过程中发挥着至关重要的作用。前列腺素(PGs)是由二十碳不饱和脂肪酸--花生四烯酸氧化代谢产生的,是重要的血管调节因子。目前已发现的具有生物活性的前列腺素家族共有五类,其中前列腺素E2 (PGE2)是最主要的前列腺素化合物,其G蛋白偶联受体根据基因编码的不同分为四种不同的亚型,分别为EP1, EP2, EP3, EP4。前列腺素E：可以通过与不同的受体结合,激活不同的信号转导通路,发挥其不同的生物学效应,进而调节全身以及肾脏的血流,调控肾脏水盐代谢及其它的功能。目前已经发现了EP1,EP2, EP4受体的信号转导路径,而EP3受体因为有着多种不同的剪接亚型,其信号转导路径并不十分清楚。然而在PGE2的四种受体中,前列腺素E2却与EP3受体的配体结合力最强,且EP3受体广泛表达于全身各种组织中,特别是在肾脏,胰腺和子宫高表达。因此,研究发现EP3受体在机体中的生物学作用,以及进一步探讨其作用的病理生理机制已经成为新的科学研究方向。实验目的：通过在两组基因型不同的小鼠(野生型及EP3基因敲除型)上建立高血压肾病小鼠模型,验证新型动物模型的可行性,并通过该模型的建立,监测小鼠机体动脉血压的变化,检测小鼠尿蛋白肌酐比值,血清尿素氮水平及肾小球滤过率的变化,以及检测肾组织中COL-Ⅰ, COL-Ⅳ, TGF-β, PAI-1, AT1等基因表达水平的改变,观察肾脏病理切片中的组织损伤程度,研究PGE2受体EP3的在高血压肾脏损伤过程中对血压变化的影响和对肾脏损伤的作用(体内实验)。并进一步通过细胞体外实验,利用LVIP2.OZc细胞对AT1受体DNA质粒和前列腺素E2受体EP3的DNA质粒进行转染,研究EP3受体在AngⅡ-AT1信号转导中的作用,为进一步的肾脏病基因治疗或新药的研发提供实验依据。实验方法：1.C57BL/6小鼠分为野生型和EP3受体基因敲除型,均于实验-14天行单侧肾切除术(右侧),0天时于皮下包埋皮醋酸去氧皮质酮(DOCA)缓释片,并将饮用水换为1%的生理盐水,于第7天为小鼠皮下包埋血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)迷你泵,以1.5ng/min/g体重的速度泵入血管紧张素Ⅱ,观察至第19天,处死小鼠。在实验过程中以尾套法每周定期监测小鼠动脉血压,收集尿液,并检测小鼠血尿素氮,肾小球滤过率,尿蛋白肌酐比值的变化,处死小鼠时收集肾脏标本,进行病理观察以及利用Q-RT-PCR技术对肾脏标本进行相关的纤维化因子的基因表达定量检测。2.复苏及培养稳定传代的LVIP2.OZc细胞,分别转染进AT1受体DNA质粒和EP3受体DNA质粒,以不同浓度的ATl受体激动剂AngⅡ和EP3受体激动剂sulprostore对转染后的细胞进行刺激,用荧光标记法使用Flex station对细胞内游离钙离子的浓度进行观察,监测细胞内钙离子浓度的变化。实验结果：1.(1)在实验过程中,小鼠包埋AngⅡ迷你泵后,野生型小鼠(WT组)23只实验动物中,16只死亡,死亡率为70%。19只EP3基因敲除小鼠(EP3-/-组)中7只死亡,死亡率为37%,使用Chi-Square统计学分析方法显示两组小鼠的生存率差异为0.0376,有统计学差异。且在WT组小鼠中,大量小鼠表现出严重的腹水,甚至全身性水肿,而EP3-/-组小鼠,即使在死亡小鼠中水肿也比较少见。其差异体现于使用AngⅡ后对两组小鼠体重改变的观察,WT组小鼠,体重明显增加,而EP3-/-组小鼠体重不仅未见明显上升,反而出现轻微的降低,平衡了初始体重后,两组小鼠体重变化统计学差异明显(P<0.001)。(2)血压变化,随治疗时间的推移,两组小鼠血压明显升高,WT小鼠的系统收缩压从基础值108.0±1.3mmHg升高到190.9±3.9mmHg,EP3-/-小鼠的系统收缩压从基础105.7±1.6 mmHg升高至199.1±4.0 mmHg,虽然两组小鼠经过处理后血压均有显著的升高,但是却没有表现出基因型不同所引起的血压差异(P=0.1939)。(3)肾功能,两组小鼠的肾小球滤过率在实验初期并无明显差异,经过处理后,WT组小鼠的肾小球滤过率明显下降至2.1±O.2μ1/min/g body weight(P<0.01),而EP3-/-小鼠的肾小球滤过率下降至5.6±0.7μ1/min/g body weight,与该组的基础值相比并无显著的统计学差异。两组小鼠在实验终止时检测的肾小球滤率过有统计学差异,WT组小鼠的肾功能显著下降。与上述研究结果一致,在检测血清尿素氮浓度时发现,两组小鼠经过处理后血清尿素氮均显著升高,WT组从基础值17.6±2.7mg/d1升高至63.7±10.3 mg/d1,EP3-/-组从基础值23.1±1.6mg/dl升高至39.0±2.1mg/dl,两组基因型不同的小鼠,在实验终末血清尿素氮浓度差异明显,P<0.0352,有统计学意义。对尿蛋白肌酐比值的观察发现,植入AngⅡ泵后,WT组ACR明显升高至2392±446.7mg/g,EP3-/-组ACR升高至704.0±136.1mg/g,组间差异显著,P<0.001。(4)纤维化因子基因表达：在实验的初期我们可以看到对于纤维化因子的表达两种基因型不同的小鼠并没有明显的差异,均显示出较低的表达值。在高血压肾病小鼠模型建立后,COL-Ⅰ,COL-Ⅳ,TGF-β以及PAI-1的mRNA表达均有所上升,且野生型小鼠(WT组)的基因表达明显的高于EP3基因敲除小鼠(EP3-/-组),两组实验动物有统计学差异,P<0.01。(5)病理学光镜检查可见肾脏系膜基质增生,肾小球硬化,肾小管扩张,大量蛋白管型,肾小管上皮细胞变性,小管灶性坏死,纤维化；间质淋巴、单核细胞浸润,伴有灶性纤维化。观察发现WT组小鼠的蛋白尿,肾小球硬化程度,肾小管坏死,间质炎症细胞浸润及纤维化程度均较EP3-/-组小鼠严重。病理半定量积分显示WT组小鼠肾小球硬化(GS)指数、小管间质病理损伤(TIL)积分均高于EP3-/-组(P<0.05)。2.通过对转染进AT1受体DNA质粒和EP3受体DNA质粒的LVIP2.OZC细胞,以不同浓度的AT1受体激动剂AngⅡ和EP3受体激动剂sulprostore进行刺激,发现单独转染了AT1受体DNA质粒的细胞,在AngⅡ的刺激下,钙离子浓度明显的呈剂量依赖性上升。在细胞共同转染了AT1受体DNA质粒和EP3受体DNA质粒后,细胞内游离钙离子浓度随着AngⅡ剂量的增加而增加,但在同时增加EP3受体激活剂sulprostore后,随着sulprostore浓度的增加,EP3受体活性的升高,细胞内钙离子浓度会在AngⅡ通过AT1刺激钙离子释放的基础上继续上升,,有统计学差异。实验结论：1.成功在C57BL/6小鼠基因背景上建立高血压肾病模型,该模型以蛋白尿,肾小球损伤,肾小管病变和纤维化因子高表达为特征。2.单独敲除EP3受体不会导致小鼠系统血压的改变。3.前列腺素E2受体EP3在高血压肾病模型中,可加重肾脏损伤。4.血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合,可以诱发细胞内钙离子释放,使细胞内游离钙离子浓度增加。5.前列腺素E2受体EP3可正向调节血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合导致钙离子增加的信号转导路径。