猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道疾病,病原是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)。该病可引起继发感染,而且猪群一旦感染该病,难以净化。目前,国内广泛使用Mhp 168株弱毒疫苗防控MPS。该疫苗能有效激发机体黏膜免疫系统,诱导产生黏膜免疫保护。随着生猪养殖规模化不断发展,对疫苗接种方式从现有的逐个免疫发展到群体免疫将有巨大的现实意义与市场前景。本试验拟将喷雾干燥技术应用于Mhp 168株干粉疫苗制备,以期实现该疫苗群体雾化免疫。研究中,通过对赋形剂、入口温度等参数优化,初步确定适合猪气雾免疫的干粉疫苗制备方法和评价指标。同时,本试验还制备两种与黏膜免疫密切相关的单克隆抗体,它们将为Mhp 168株干粉疫苗黏膜免疫效果评价提供试验材料。本研究主要从以下几个方面开展:1、根据文献资料,试验首先比较两种赋形剂喷雾干燥效果,确定以赋形剂MTPCD作为后续试验赋形剂基准。试验中,根据制备出的干粉菌体活力、颗粒粒径和形态等指标对赋形剂配方、入口温度、出口温度、抽气速度、进样速度等参数进行优化,制备出粒径为2-5μμm、形态为球形的干粉颗粒,该颗粒可以经气雾免疫,沉积于猪下呼吸道;同时,检测发现干粉玻璃态转化温度大于40℃,表明其可以在室温中保存。2、通过对GenBank公布的猪多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因序列分析,找到编码猪分泌片(SC)蛋白基因,然后设计特异性引物,从猪气管上皮细胞中成功扩增出猪SC蛋白基因。将该基因插入表达载体pColdI中,构建重组表达载体pColdI/SC,并转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达出目的蛋白。利用Ni柱和PAGE胶回收方法纯化出高纯度的猪SC重组蛋白。Western blot鉴定表明该重组蛋白具有良好的反应原性。将猪SC重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经5次细胞克隆,建立3株杂交瘤细胞株。特异性检测表明,3株单抗可结合猪SC重组蛋白、猪SC天然蛋白,且与猪IgA、猪IgG及大肠杆菌全菌蛋白无交叉反应。亚型检测表明,3株单抗亚型分别为IgG1/κ、IgG1/κ和IgG2α/κ。效价检测表明,3株单抗腹水效价均为1:100000。3、试验将猪sIgA蛋白免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤细胞技术制备猪sIgA单克隆抗体。经过3次细胞克隆,获得3株稳定分泌抗猪sIgA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1D8、IF10和1F11。Western blot分析表明,3株单抗均与猪IgA重链反应,与猪IgG无交叉反应。亚型鉴定显示,3株单抗亚型均为IgG1/κ。腹水效价检测表明,最高效价达1:1000000。综上所述,本研究对Mhp 168株干粉疫苗的制备进行了探索,初步确定制备方法和评价指标。但该干粉疫苗依然需要进一步优化。同时制备出两种与黏膜免疫相关单克隆抗体,它们将用于评价Mhp 168株干粉疫苗免疫效果。