【摘 要】
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目的:培养实验所需的大鼠支气管成纤维细胞（Rat bronchial fibroblasts,RBFs）并对其进行鉴定,探讨IL-17A对RBFs的自噬以及自噬后相关胶原合成及降解的影响,同时在IL-17A抑制RBFs自噬活性的基础上,探讨IL-17A是否可通过激活PI3K/AKT/m TOR信号通路调控RBFs的自噬。方法:1、酶联合消化法+组织块贴壁法培养RBFs,免疫荧光法（IF）对RBFs
【基金项目】
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IL-17A通过PI3K/AKT/mTOR途径调节支气管成纤维细胞自噬在COPD气道炎症及气道重塑过程中的作用（来源:国家自然科学基金，编号:82060005）； 贵州省科技计划项目（黔科合支撑S[2020]2378）； IL-17A通过自噬调控支气管成纤维细胞胶原及炎症因子分泌的实验研究（来源:贵州省研究生科研基金立项课
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目的:培养实验所需的大鼠支气管成纤维细胞（Rat bronchial fibroblasts,RBFs）并对其进行鉴定,探讨IL-17A对RBFs的自噬以及自噬后相关胶原合成及降解的影响,同时在IL-17A抑制RBFs自噬活性的基础上,探讨IL-17A是否可通过激活PI3K/AKT/m TOR信号通路调控RBFs的自噬。方法:1、酶联合消化法+组织块贴壁法培养RBFs,免疫荧光法（IF）对RBFs标志蛋白波形蛋白进行鉴定。2、CCK8法检测IL-17A、雷帕霉素干预RBFs最适浓度和时间。3、自噬水平的检测:实验分组:（1）对照组;（2）IL-17A组;（3）雷帕霉素组（Rapa组）;（4）雷帕霉素+IL-17A组（Rapa+IL-17A组）。采用Western blot（WB）检测各组RBFs中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1、P62的表达水平变化;采用透射电镜（TEM）观察各组RBFs细胞内自噬小体（autophagosomes,AP）数量的变化。4、胶原合成水平的检测:采用WB和IF检测各组Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白的表达水平变化。5、胶原降解水平的检测:采用ELISA法检测各组RBFs培养上清液中基质金属蛋白酶-1（Matrix metalloproteinase-1,MMP-1）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（Matrix metalloproteinase inhibitor-Force1,TIMP-1）含量的变化。6、PI3K/AKT/m TOR信号通路水平的检测:分组:（1）Control组;（2）IL-17A组。采用WB检测IL-17A对PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白激活的影响。加入LY294002特异性抑制PI3K的磷酸化后检测AKT和m TOR的活化情况以及P62蛋白的表达。结果:1、酶联合消化法+组织块贴壁法可成功培养RBFs,呈梭形、多边形,IF鉴定其表面标志物波形蛋白呈强阳性。2、CCK8法结果显示,Rapa诱导RBFs自噬的最佳处理浓度为2umol/L,最佳处理时间为24h。IL-17A促进RBFs增殖的最佳干预浓度为20ng/mL,最佳干预时间为24h。3、IL-17A可抑制RBFs的自噬:WB结果显示,与Control组相比,IL-17A组RBFs中LC3与Beclin1蛋白表达显著减少（P<0.05）,P62蛋白表达显著增加（P<0.05）,雷帕霉素部分逆转了IL-17A的作用。TEM结果显示,与Control组相比,IL-17A组RBFs中AP数量减少,雷帕霉素部分逆转了IL-17A的作用,说明IL-17A能抑制RBFs的自噬水平。4、IL-17A通过抑制RBFs自噬促进胶原产生:WB和IF结果显示,与Control组相比,IL-17A组RBFs中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ合成增加（P<0.05）,雷帕霉素部分逆转了IL-17A的作用,说明IL-17A通过抑制RBFs自噬促进胶原产生。5、IL-17A可调控RBFs自噬后胶原降解:ELISA结果显示,与Control组相比,IL-17A组细胞上清液中MMP-1表达水平降低（P<0.05）,TIMP-1表达水平升高（P<0.05）;雷帕霉素部分逆转了IL-17A的作用,说明IL-17A抑制RBFs自噬后抑制相关胶原降解。6、IL-17A可调控RBFs中PI3k/AKT/m TOR信号通路蛋白的表达:与Control组相比,IL-17A组RBFs中PI3K、Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平明显增高（P<0.05）。加入LY294002特异性抑制PI3K的磷酸化后,可抑制IL-17A刺激引起的AKT、m TOR蛋白磷酸化和P62蛋白表达增高过程,从而逆转IL-17A诱导的RBFs细胞自噬抑制过程。结论:1、利用酶联合消化法+组织贴壁法可有效培养出纯度较高的RBFs。2、IL-17A通过抑制RBFs的自噬促进Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的合成。3、胶原降解的抑制与IL-17A抑制RBFs自噬活性有关。4、PI3K-Akt-m TOR通路活化可能是IL-17A抑制RBFs自噬的分子机制。
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