乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor,AChR)是一种配体介导的离子通道蛋白，由2α，β，γ(ε)，δ共5个亚基组成。其中成熟的α亚基是自身免疫病重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)的主要免疫原，重症肌无力患者由于自身免疫系统的紊乱，体内产生了非正常的乙酰胆碱受体抗体，该抗体可与乙酰胆碱受体的α67-76，α125-147，α183-200氨基酸残基结合，减少功能性乙酰胆碱受体数量，抑制乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合，阻碍骨骼肌间神经传导。因此，长期以来，科学家们一直以AChRα-亚基N-端主要功能区片段为研究对象，从不同角度探讨MG的发病机理及其治疗的可能手段。本论文在前期工作的基础，着重进行了以下几个方面的研究。　　AChRα205读框被克隆到含不同启动子的表达载体中（如pUC118，pET32M，pMAL-c2等）中，并在E.coli BL21中进行表达，其中目的蛋白只有在重组菌E.coli BL21/pMAL-AChRα205中获得了可溶性表达产物MBP-AChRα205，表达量可达到细胞总蛋白的30％，这也是国内外第一次获得AChRα亚基主要功能区的可溶性表达。经Amylose亲和纯化获得了融合蛋白MBP-AChRα205，而且经Factor Xa拆除可获得单一的AChRα205。同时，偶联在Amylose的MBP-AChRα205可作为一种免疫吸附剂。对小鼠抗AChR血清的免疫吸附实验表明，大约75％-98％的AChRAb可以被特异性清除，而血清蛋白、IgG、IgM、IgA仍能维持在正常水平。2例MG病人血清经该免疫吸附剂吸附后，AChRAb的清除率可达90％以上，清除效率要比那些化学合成的免疫吸附剂高的多。ELISA验证在免疫吸附过程中，没有MBP-AChRα205或AChRα205的脱落。　　同时，我们也将目的基因片段延伸到AChRα211，并克隆到酵母表达载体pVT、pGAPZαA、pPIC9K中，转入酿酒酵母和毕赤酵母中进行分泌型表达。实验结果表明，重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-AChRα211可以分泌表达有功能活性的目的蛋白，表达量可达到25mg/L。经阴离子交换层析和凝胶过滤层析，可获得电泳纯目的蛋白，并制备成免疫吸附剂，对两例肌无力患者血清中的AChRAb清除率可分别达到84％和94％。　　随着内蛋白子(intein)自剪接机理的阐明，在蛋白质工程领域利用内蛋白子自剪切性质快速纯化重组蛋白的技术已日趋成熟，但对intein介导的蛋白质连接技术的研究尚处于探索阶段。本实验利用内蛋白子纯化系统先表达了单链核糖体失活蛋白Gelonin，目的蛋白主要以包涵体形式存在，经过阶段透析复性，复性率可达到60％以上。复性后的融合蛋白上样于几丁质亲和柱，pH6.5，25℃诱导intein C端白剪切反应，48小时后重组蛋白Gelonin就可以从亲和柱上洗脱下来，每升菌可得到大约1.2mgGelonin蛋白，虽然利用intein自剪切功能纯化的重组蛋白Gelonin N端含有CySH，但不影响其活性，重组蛋白对无细胞体系蛋白质合成的抑制浓度IC50为20PM。同时，我们将AChRα211插入到intein表达载体中，经转化诱导表达，包涵体变复性等，用100mM MESNA诱导inteinN端自剪切，获得C端带有COSR官能团的目的蛋白AChRα211，接着AChRα211-COSR和CySH-Gelonin在一定实验条件下，使SH对COSR进行亲核攻击合成免疫络合物AChRα211-Gelonin。SDS-PAGE测定表明形成了一条51kDa的条带，而且Western blot分析表明，该条带同时具有AChRα211和Gelonin的双重免疫活性。虽然蛋白质体外连接产率低，难以获得一定量做进一步深入研究，但这一结果初步表明，intein介导的蛋白质连接技术为免疫毒素的体外构建开辟了一个新的方法。　　基因免疫是近年来基因治疗的一个方向。为使该研究更趋于实用化，将AChRα211基因片段插入到穿梭载体pcDNA3.0中。经大量提纯重组质粒pcDNA-AChRα211后，将其直接肌肉注射于小鼠C57BL/6。经两次加强免疫后，受试小鼠有轻微的肌无力症状，引起了体液免疫，而且在其血清中可检测到相应的抗体AChRAb，效价可达1∶320。同时，解剖小鼠，提取其肌肉、脾脏、肾脏、肝脏等组织器官的基因组，并用PCR方法检测脏器内目的基因的存在。实验结果表明，目的基因AChRα211确实整合到了受试小鼠的基因组中，而且重组质粒在小鼠体内（肌肉、脾脏、肾脏、肝脏）可存留至少3个月。这一初步尝试为快速建立肌无力动物模型并对其进行机理研究提供了一种便捷手段。