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研究背景:氟是人体维持正常生命运转不可或缺的一种微量元素,然而当氟的摄入量超标时,也可导致人体发生各项生理或病理方面的改变,甚至会对身体带来损害,其造成损害的部位主要集中于骨组织内。地方性氟中毒以其普遍、顽固以及病发严重、不可逆等特征成为目前为止引起全国乃至全世界注意的地方病之一。而氟骨症正是其特征性损害之一。国内外学者发现氟骨症患者后期常常伴有骨软化和骨质疏松等骨量减少的特征性改变,而过量氟、骨细胞和破骨细胞三者相互作用的机制罕见报道。研究证明骨细胞是诱导破骨细胞分化的核因子NF-κB受体激活剂配基(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的主要来源。骨细胞深埋在骨基质中,很难进行体内外的观察和研究。这也导致涉及骨细胞的骨代谢研究很少。甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)在调控骨转换过程中发挥重要的作用。PTH能够与成骨细胞和骨细胞表面的PTH受体(parathyroid hormone 1 receptor,PTH1R)结合,调控各类细胞因子的分泌间接对破骨细胞分化产生诱导作用。本项目在前期工作分析了氟化钠对原代骨细胞活性和相关因子表达基础上,利用骨细胞系IDG-SW3细胞开展了如下工作,通过探究氟联合PTH调控的骨细胞产生RANKL,诱导破骨细胞分化中的作用,从而明确PTH在其中的地位。这在以往的氟骨症机制研究中罕见报道。本成果将为氟骨症相关研究提供线索和依据。实验方案:1.染氟联合PTH处理IDG-SW3细胞实验:我们首先对IDG-SW3细胞进行矿化诱导培养,发现矿化诱导28天后IDG-SW3细胞能稳定表达硬化蛋白(Sclerostin,SOST),说明细胞转化为骨细胞。取矿化诱导28天后IDG-SW3细胞,在0.001~32mg/L区间设置一系列不同F~-浓度梯度的培养基培养7天。培养结束后,采用MTT法检测各组IDG-SW3细胞的细胞活性。选取代表性氟浓度加入浓度为10nmol/L的细胞因子PTH(1-34)进行处理7天。培养结束后进行细胞活性的分析,并采用BD公司的Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡率。利用0.5、4和16 mg/L氟联合PTH处理骨细胞7天,利用Western Blot技术检测不同实验条件下IDG-SW3细胞中保护素(osteoprotegerin,OPG)、SOST及RANKL的表达变化。2.染氟RAW264.7细胞诱导的破骨细胞实验:我们以小鼠单核细胞系RAW264.7为研究对象,通过培养液中添加RANKL诱导细胞融合分化为破骨细胞,同时采用在0.001~16mg/L区间设置一系列不同F~-浓度梯度的培养基培养7天。培养结束后,采用MTT法检测各组RAW264.7细胞的细胞活性。在培养基含有RANKL的条件下,选取代表性氟浓度联合10ng/ml的转化生长因子β1(Transforming growth factor beta,TGF-β1)处理细胞7天。培养结束后,采用BD公司的Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.染氟联合PTH处理骨细胞与破骨细胞体外共培养实验:依据前面实验结果,氟在4mgF~-/L条件下能够显著刺激破骨细胞分化,并刺激IDG-SW3细胞分泌RANKL来诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。本实验采用IDG-SW3细胞矿化诱导28天后,利用Transwell细胞小室与RAW264.7细胞共培养,诱导其进行破骨细胞分化。IDG-SW3细胞培养在预先铺好I型胶原的24孔板上,RAW264.7细胞培养在Transwell细胞小室上层,共培养7天。分别设置空白对照组、0.5、4和16 mgF~-/L组或者联合PTH处理细胞,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色和Diff-Quick染色,光镜下统计各组RAW264.7细胞中TRAP染色阳性的破骨细胞样细胞数量以及细胞的迁移数量。下一步我们对不同条件影响骨细胞诱导破骨细胞分化的机制进行了基因水平分析。IDG-SW3细胞培养在预先铺好I型胶原的6孔板上,RAW264.7细胞培养在Transwell细胞小室上层,设置空白对照组、4mgF~-/L组联合PTH处理细胞7天。培养结束后收集细胞,利用实时定量PCR分别检测RAW264.7细胞和IDG-SW3细胞暴露于氟及PTH等不同条件下各相关信号通路以及相应因子在基因水平的表达情况。实验结果:1.染氟联合PTH处理IDG-SW3细胞实验结果:细胞活性分析结果表明极低剂量的氟对骨细胞活性的抑制,低剂量到中剂量氟能够轻度提高细胞活性,而高剂量氟对细胞活性的抑制显著,显示了不同剂量的氟对细胞活性影响成倒U型趋势。氟离子(F~-)联合PTH处理骨细胞后,可观察到PTH能够明显抑制骨细胞活性。细胞凋亡实验证明高剂量氟化物显著增加骨细胞的凋亡,氟联合PTH作用细胞的凋亡率较单独氟处理组明显提高。这些结果与PTH降低骨细胞活性的作用结果一致。我们观察不同时间骨细胞内表达SOST和RANKL的情况,发现IDG-SW3细胞在矿化21天后才检测到SOST的表达,而RANKL蛋白在矿化诱导的各个时间节点都表达,说明了在矿化诱导培养21天后IDG-SW3细胞分化成为骨细胞,而从成骨细胞晚期到骨细胞都表达RANKL,这些结果与该细胞特征相一致。染氟联合PTH处理细胞一定时间后,蛋白检测结果发现,氟或者PTH单独作用抑制骨细胞表达SOST蛋白,PTH联合低剂量氟也是抑制SOST的表达。单独氟对骨细胞RANKL蛋白的表达影响不显著,而PTH联合低量氟显著增加了RANKL的表达,比较之下,氟抑制了OPG表达,而且PTH联合氟加重了该蛋白表达的下降,显示出氟作用下PTH抑制OPG表达的特异性作用。2.染氟RAW264.7细胞诱导的破骨细胞实验结果:根据RAW264.7细胞的MTT细胞活性结果,在RANKL诱导细胞分化为破骨细胞的情况下,极低剂量0.01mgF~-/L组细胞活性较对照组显著降低,而中剂量4mgF~-/L组细胞活性达到最高值,高剂量氟16mgF~-/L组细胞活性最低,验证了氟化物刺激破骨细胞活性的影响呈倒U型趋势。染氟RAW264.7细胞在RANKL诱导分化为破骨细胞的情况下,细胞凋亡实验结果表明,低和中剂量的氟对破骨细胞凋亡影响不明显,高剂量氟促进破骨细胞的凋亡,TGF-β1加重了高量氟对该细胞凋亡的促进作用。3.染氟联合PTH处理骨细胞与破骨细胞体外共培养实验结果:以共培养模拟体内环境可以更好观察细胞之间的关联和信号途径。在不同氟剂量联合PTH处理条件下,IDG-SW3细胞分泌RANKL来诱导共培养的RAW264.7分化为破骨细胞,各组RAW264.7细胞不同程度地分化为TRAP染色阳性多核破骨细胞,计数破骨细胞数量后发现中剂量和高剂量氟促进破骨细胞分化,而且PTH单独或者联合氟作用也能够促进这种分化作用。细胞迁移率实验结果都显示了在4mgF~-/L组破骨细胞迁移率最高。实时定量PCR检测Transwell底层骨细胞中发现,氟显著抑制了成骨抑制剂DKK1的表达,而PTH联合氟明显提高了SOST和DKK1的表达;在诱导破骨细胞分化方面,PTH单独或联合氟作用下,骨细胞表达OPG显著降低,而RANKL的表达只在两者联合作用组显著提高;RANKL:OPG比值在PTH作用的两组都显著提高。Transwell小室上层RAW264.7细胞的基因水平分析结果表明,染氟或联合PTH诱导有促进RAW264.7细胞中破骨标志TRACP基因的表达,单独PTH作用下组织蛋白酶K(Cathespin K)表达升高。破骨细胞分化的关键转录因子核因子NF-κB受体激活剂(Receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)及其下游JNK和T细胞激活的核因子c1(nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc1)的表达和TRAP基因的变化相类似,证明氟能够促进骨细胞诱导诱导破骨细胞分化。最后我们发现,氟化物刺激和PTH诱导的作用下RAW26.7细胞中Wnt10b的表达显著升高,而PTH诱导却可以显著降低Notch1和β-catenin的基因表达量。结论:氟化物对骨细胞和破骨细胞活性影响都是呈倒U型趋势,极低剂量氟抑制骨细胞和破骨细胞活性,低剂量和中剂量不同程度低刺激两种细胞活性,高剂量氟均显著抑制两种细胞活性,而骨细胞对高剂量氟的耐受力较破骨细胞强。PTH不仅抑制骨细胞活性,联合氟作用下可以增加骨细胞的凋亡。氟抑制单独培养的骨细胞表达SOST和OPG蛋白;PTH联合氟处理进一步抑制了SOST和OPG蛋白的表达,增加了RANKL蛋白的表达。在骨细胞和破骨细胞共培养条件下,一定剂量氟通过抑制骨细胞内OPG表达,提高RANKL:OPG比值来诱导共培养破骨细胞的分化和迁移,并且主要是利用RANK-JNK-NFATc1途径来刺激破骨细胞分化。氟刺激和PTH作用下破骨细胞内Wnt10b的基因表达提高,增强破骨细胞诱导成骨的能力;PTH显著降低了破骨细胞中Notch1来上调RANK的表达来调控破骨细胞分化。另一方面PTH也可以通过降低破骨细胞β-catenin的基因表达量,间接影响骨细胞表达OPG来达到诱导破骨细胞分化的能力。当然,我们的结论是依据基因水平的变化得到的,在下一步工作中尚需要在蛋白水平上验证,并且利用基因干扰技术明确氟影响骨细胞调控破骨细胞分化的靶点。