持续性心肌缺血将导致心肌组织严重损伤、甚至细胞死亡。及时开通闭塞血管、实现再灌注是挽救缺血心肌损伤最有效方法,但研究显示再灌注却可加重心肌细胞的损伤,即缺血-再灌注损伤。因此,心脏缺血-再灌注损伤目前仍是经皮穿刺冠脉腔内成形术、冠脉搭桥术、心脏移植术、各种冠脉再通术后一个重要的并发症,也是导致心脏功能远期预后不良的主要原因之一,有关其机制和保护措施的研究一直倍受关注。　　心肌β肾上腺能受体(β-adrenergic receptor,β-AR)介导的信号传递系统与心功能有着密切的关系。研究表明,心肌的缺血再灌注损伤与交感神经及心脏肾上腺素受体过度兴奋,增加心肌耗氧量有关,其最终导致氧自由基的形成、心肌细胞内钙超载和细胞凋亡,因而造成心肌损伤。　　既往一直认为心脏β-AR与β-AR都是偶联Gs蛋白,通过Gs-AC-cAMP的信号途径调节心肌功能,甚至认为β-AR只是β-AR的一个功能储备。但近来研究发现β-AR可同时与G和G的混杂偶联,使其具有调节心脏功能的平衡作用。研究表明在衰竭心脏和缺血心脏的病情发展中β2-AR起着不可忽视的作用。　　同时,众多研究认为刺激β-AR会导致心肌细胞凋亡,而刺激β-AR会逆转促细胞凋亡的一些信号,使细胞免受促细胞凋亡因素的入侵,包括低氧和活性氧家族,其净效应是促使细胞存活。Steve等研究表明选择性地β-AR激动剂clenbuterol可通122过β-AR/G信号途径,改善心肌病理性的损害,减轻凋亡对心肌的损害。因此,研究结果提示β-AR信号通路可能在心肌缺血再灌注损伤的调节中起重要作用。但是,β-AR激动剂是否对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,目前尚无报道。因此,本学位论文就β-AR激动剂clenbuterol对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行研究,由二部分组成:①Clenbuterol对大鼠缺血/再灌注后心肌2 i222损伤的保护作用及机理探讨;②Clenbuterol对H O诱导心肌细胞损伤的保护作用及其机制研究。若能够明确β-AR激动剂确实能防止再灌注心肌细胞损伤,则可以针对性地激活β-AR发挥心肌保护作用,从而为有效地防治缺血再灌注心肌开辟了一个崭新的空间。　　第一部分β2-AR激动剂对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机理探讨　　心肌缺血-再灌注损伤与心脏β1-AR-Gs-AC-cAMP过度兴奋相关,β-AR在心肌细胞可通过β-AR/G偶联局限Gs偶联介导的cAMP-PKA信号。因而,β-AR激动剂可能改善心脏缩舒功能。此外,氧自由基是心肌缺血-再灌注损伤重要的发病机制,它们与β-AR及相关信号转导通路是否有内在的联系。同时,2 i22细胞凋亡参与心肌缺血-再灌注损伤的过程,激动β-AR是否能拮抗缺血-再灌注心肌细胞凋亡,目前相关研究尚少。　　目的:　　本实验就β-AR激动剂clenbuterol对大鼠离2体心肌缺血-再灌注损伤的作用及其可能的作用机制进行了研究。　　方法:　　采用Langendorff离体心脏灌流模型,全心停灌30min复灌60min建立缺血再灌注模型,分别于缺血前10min预先给予选择性β2-AR激动剂Clenbuterol(1umol/L)和选择性β2-AR阻断剂ICI118,551(30nmol/L),经多道生理信号采集处理系统记录灌流过程中左心室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)和心率(HR)的动态变化,并收集冠脉流出液,记录平衡灌流末和再灌注第20、30、40、50、60min时间点的冠脉流量(CF),测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)含量。测定心肌组织超氧化物歧物酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;免疫组化法检测iNOS,eNOS蛋白表达;检查心肌的组织学检查。应用TUNEL法进行心肌细胞凋亡检测,通过免疫蛋白印迹法测定凋亡相关蛋白caspase-3的表达,RT-PCR检测Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达。　　结果:　　模型组,HR、LVSP、±dp/dtmax、CF、较对照组均降低,LVEDP有所增加。冠脉流出液中LDH的含量升高,心肌组织MDA生成增加,SOD活性下降。心肌纤维可见排列不规则,结构紊乱,肌纤维空隙增宽,并可见部分心肌细胞出现溶解、坏死。此外,模型组冠脉流出液NO含量下降,eNOS的免疫组织化学阳性物质显著性减少,各组组织切片的iNOS免疫组织化学染色均未获得阳性结果。TUNEL结果显示,模型组心肌细胞凋亡程度显著增加,Bcl-2 mRNA和蛋白表达有所下降,而Bax mRNA和蛋白表达明显增多;caspase-3蛋白表达显著增多。　　与模型组比较,β2-AR激动剂clenbuterol组可明显减轻心肌缺血再灌注损伤,表现为降低LVEDP,升高CF,SOD活力、NO含量增加,MDA、LDH含量、心肌病理性损伤均不同程度降低,eNOS蛋白表达增加,心肌细胞凋亡率减少,Bcl-2 mRNA和蛋白表达上升,而Bax mRNA和蛋白、caspase-3蛋白表达下降。以上的作用均可被选择性β2-AR阻断剂ICI118,551不同程度阻断。　　结论:　　1.Clenbuterol可使LVEDP下降,增加冠脉流量,提示Clenbuterol可能通过激动血管平滑肌的β2-AR,扩张冠脉,从而改善心脏的舒张功能,减少心脏作功,进而改善心肌氧的供求关系。　　2.Clenbuterol可减轻自由基对心肌细胞的损伤,抗脂质过氧化,降低心肌酶的释放,从而改善缺血再灌注心肌能量代谢障碍。　　3.Clenbuterol可显著改善缺血再灌注心肌组织的NO生成和eNOS表达,提示Clenbuterol的心肌保护作用与NO有关。　　4.Clenbuterol增加Bcl-2表达,降低Bax表达,上调Bcl-2/Bax表达,下调caspase-3的表达,从而抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡,促进心肌细胞存活。　　第二部分β2-AR激动剂对心肌细胞H2O2损伤的保护作用　　研究发现,心脏疾病时(如缺血-再灌注、心肌梗塞、心衰、心室肥大等)细胞内活性氧水平增加和抗氧化剂水平的降低能直接诱导细胞凋亡。因此,氧化应激-心肌细胞凋亡-心脏疾病之间有着密切的联系。基于前一部分的实验结果表明,β2-AR激动剂clenbuterol能够抑制心肌细胞凋亡,而氧自由基与细胞凋亡的关系密切。　　目的:　　本研究通过外源性H2O2作用于培养的乳鼠心肌细胞,来探讨clenbuterol对H2O2诱导的心肌细胞损伤和凋亡的保护作用。　　方法:　　建立H2O2所致原代新生大鼠心肌细胞损伤模型,通过细胞形态学、细胞存活率、LDH、MDA含量和SOD活性测定,研究clenbuterol对H2O2损伤心肌细胞的抗氧化作用;通过流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化、免疫组化检测caspase-3蛋白表达,Western Blotting检测磷酸化Akt蛋白的表达,研究clenbuterol对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的作用及其机制。　　结果:　　1.单独给予clenbuterol组各项指标与正常心肌细胞比较无显著性差异。模型组心肌心肌细胞存活率较正常组下降,LDH活性、MDA含量显著增高,SOD活性较正常组心肌细胞下降。Clenbuterol+H2O2组心肌细胞存活率、SOD活性较模型组显著增高,而LDH活性、MDA含量较模型组明显降低,选择性β2-AR阻断剂ICI118,551可抑制clebuterol的保护作用。　　2.本实验结果显示,Clenbuterol+H2O2可使心肌细胞的凋亡率、caspase-3表达量减少,磷酸化Akt表达量较模型组增加,而阻断剂ICI118,551组可抑制clenbuterol的抗凋亡作用。　　结论:　　1.0.1mM H2O2对心肌细胞具有损伤作用,表现心肌细胞存活率降低,形态学发生改变,增加LDH活性、MDA含量,降低SOD活性,使心肌细胞受到氧自由基损伤,并诱导心肌细胞凋亡的发生。　　2. Clenbuterol可拮抗0.1mM H2O2诱发的心肌细胞凋亡,对氧化损伤的心肌细胞具有保护作用。其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。