目的:脐带间充质干细胞（UC-MSCs）具有自我更新、多向分化潜能和免疫抑制功能,已被多项临床试验证明其对多种疾病具有良好的治疗效果。UC-MSCs具有方便获得、遗传稳定性好、免疫原性低、组织修复能力强等优点,其在临床上的应用前景非常可观。本研究旨在建立一套基于无血清培养体系的人UC-MSCs制备方法,对获得的细胞的生物学特性和功能进行鉴定,并利用糖尿病足小鼠模型对所制备的UC-MSCs进行疗效评价,为研发治疗糖尿病足等疾病的干细胞药物奠定基础。研究方法:1、采用无血清、无动物源且化学成分限定的培养体系制备UC-MSCs,利用CCK-8法对接种密度、促贴壁物质浓度进行优化。显微镜观察细胞形态,记录细胞的贴壁及生长情况,并采用CCK-8法测定细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞表面标志物,分别利用油红-O染色法、茜素红染色法和阿尔新蓝染色法对UC-MSCs的成脂、成骨、成软骨分化潜能进行鉴定。采用UC-MSCs与淋巴细胞共培养试验评价其免疫抑制功能。2、利用C57小鼠建立糖尿病下肢缺血足溃疡模型,分别采用病灶周围局部注射和尾静脉注射UC-MSCs两种方式开展疗效试验,注射干细胞后,每隔三天拍照一次,记录伤口溃烂或愈合情况,持续记录18天,其间每隔五天利用小动物自主活动仪测定小鼠的自主站立次数,此外,对于尾静脉注射UC-MSCs治疗组,连续五周监测血糖变化,并于试验终末取小鼠胰腺进行HE染色观察组织结构变化。结果:1、确定1%为促贴壁物质的最佳使用浓度,12000个/cm2的密度为UC-MSCs最佳传代的密度。所制备的UC-MSCs呈梭形、旋涡状贴壁生长,经流式细胞术测定,所制备细胞表面CD73、CD90、CD105的阳性表达率分别为99.9±0.59%、100.0±0.00%和97.4±2.19%;CD34、CD45和HLA-DR的阳性表达率分别为0.80±0.76%、1.00±0.29%和0.10±0.26%。在特定诱导条件此下,能成功分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。此外,所制备细胞对淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用。2、本研究制备的UC-MSCs能够明显促进糖尿病足模型小鼠的伤口愈合,明显改善模型小鼠的自主站立活动能力,其中以尾静脉注射组疗效更为明显,此外,尾静脉注射组的模型小鼠的血糖水平明显下降,胰腺组织结构得到明显改善。结论:1、本研究制备的UC-MSCs在形态特征、增殖能力、表面标志物表达、分化潜能等方面均符合国际细胞治疗协会确定的间充质干细胞鉴定标准;此外,还对淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用。以上结果表明,利用本研究的制备方案能够制备出具有良好生物学功能的UC-MSCs。2、本研究制备的UC-MSCs能够明显促进糖尿病足小鼠伤口愈合,改善糖尿病症状,具有极大的改善和治疗人类相关难治性疾病的潜力,具备极大的临床应用价值。