桑葚(Mori Fructus),桑科桑属植物桑树的果实,性甘温,味酸甜,具有滋阴补血、补益肝肾、清肝明目等药效,记载于2015年版药典,进入了药食同源原料目录(2019)中。桑葚多糖(Mori Fructus Polysaccharide)是桑葚中最主要的生物活性物质,具有如抗肿瘤、抗氧化、抗菌,降血糖、降血脂及免疫调节等多种生理活性。因桑葚中多糖组分生物活性广泛,且桑葚产量巨大,而受到了医药、保健功能食品研发方向的科研人员的关注,是新药研发的主要目标之一。前期课题组研究表明,桑葚多糖是潜在的良好的保肝天然药物。此前并未研究桑葚多糖的作用部位,影响了桑葚多糖进一步开发与利用,因此,本研究使用ELISA酶联免疫法研究了桑葚多糖及其衍生物对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)激活Kupffer细胞(KCs)免疫作用的影响,从而确定桑葚多糖是否通过Kupffer细胞发挥其护肝的作用功效,为研究桑葚多糖作用机制奠定基础。此外,前期研究发现,桑葚多糖能抑制MCF-7细胞增殖,具有抗癌活性。因此,笔者选取了八种对人体危害较大、患病率较高的癌细胞,使用MTT法研究了桑葚多糖及其衍生物对八种癌细胞的抑制活性,探索了桑葚多糖对目的细胞抑制作用的量效关系、时效关系,使用细胞划痕实验探究了桑葚多糖对目的细胞细胞迁移的抑制作用。得到的实验结果如下:1.对Kupffer细胞的提取方法进行优化,调整灌注管道长度为0.9 m、将充分撕碎的肝脏延长消化时长15 min、采用Percoll液差速离心法对提取得到的细胞进行纯化,大幅度提升了获得的细胞数量及细胞吞噬活性。2.三种MFP-30-1多糖浓度降低MDA水平能力顺序为1.0 mg·m L-1>0.5mg·m L-1>2.0 mg·m L-1,考虑到不同浓度多糖的效率,选择0.5 mg·m L-1为桑葚多糖实验浓度。初筛实验中,两组分阳性药(PDTC、DDB)和十种桑葚多糖均能不同程度抑制LPS诱导的Kupffer细胞上清液MDA水平的上升。3.正式试验中,使用十二组药物对Kupffer细胞进行处理,检测了细胞上清液中的MDA、NO、IL-6、IL-1β和NF-κB的含量及TNF-α和i NOS的活力值。实验结果显示:使用十二组药物处理LPS激活的Kupffer细胞24 h后,MDA、NO、IL-6、IL-1β和NF-κB的含量以及TNF-α和i NOS的活力值均有大幅度下降,个别药物能降低一种或多种上述指标含量基本回复至正常水平,提示十二组药物均能显著抑制LPS激活Kupffer细胞的免疫作用。其中MFP-70-1可以大幅降低因LPS作用而引起的MDA、IL-6和TNF-α大幅上升(P<0.01),具有较好的生物活性。根据实验结果可得,桑葚多糖及其衍生物可以通过调节Kupffer细胞中NF-κB信号通路的表达,下调相关细胞因子含量来调节LPS激活Kupffer细胞的免疫调节作用。对本部分研究的七个指标而言,两组分阳性药、十种桑葚多糖及其衍生物对这七个指标的降低效果顺序并不相同,可能提示十二组药物调节Kupffer细胞免疫作用是一个极复杂的过程,除NF-κB信号通路参与这一过程外,还有别的信号通路参与了这一过程。4.桑葚多糖及其衍生物对选取的八种癌细胞中的七种有较好的抑制活性。MTT实验结果显示,桑葚多糖对选取的多种细胞表现出显著的抑制作用(P<0.05),选择其中抑制活性大于60%的桑葚多糖进行后续研究。其中,在2 mg·m L-1的浓度上,桑葚多糖对He La细胞抑制活性不高,抑制率均在60%以下。S-MFP-30、MFP-50-2及MFP-70-2对MKN-45细胞具有极好的抑制作用,抑制率分别为91.35±0.49%、71.8±0.37%及72.44±0.44%(P<0.01);四组分桑葚多糖对NCI-H1650细胞具有较为显著的抑制作用,四种多糖及抑制率分别为:S-MFP-30(95.06±0.43%)、MFP-50-1(63.69±0.32%)、MFP-50-2(73.35±0.49%)及MFP-70-2(82.03±0.32%)(P<0.01);MFP-30-2、SMFP-30、MFP-50-2和MFP-70-2四组分多糖抑制MCF-7细胞增殖的能力较为显著,抑制率分别为67.9±0.28%、99.95±0.03%、79.27±0.45%和74.05±0.44%,具有极显著差异(P<0.01);六种多糖能显著抑制OVCAR-3细胞的细胞增殖作用,六组分多糖及其抑制率分别为MFP-30-2(67.36±1.50%)、S-MFP-30(95.78±0.64%)、MFP-50-1(70.68±1.21%)、MFP-50-2(77.27±0.59%)、MFP-70-2(78.76±0.72%)和MFP-90-2(73.91±0.80%),具有极显著差异(P<0.01);十种多糖中仅有S-MFP-30对Hep G-2细胞的抑制率最高,其抑制率为90.32±1.23%(P<0.01);两种桑葚多糖对A549细胞增殖的抑制效果显著,两组分桑葚多糖及其抑制率分别为:MFP-50-2(78.45±1.33%)、MFP-70-2(68.81±1.64%);最后,两组分多糖对NCI-H292细胞的增殖抑制作用最为明显,其抑制率分别为:MFP-50-2:73.91±1.14%、MFP-70-2:69.73±1.82%,具有极显著差异(P<0.01)。MTT实验结果显示,随着多糖浓度和作用时间不断增加,桑葚多糖对目的细胞的抑制率明显增强,表明桑葚多糖抗肿瘤活性具有明显的量效、时效关系。细胞划痕实验结果显示,桑葚多糖能大幅度抑制癌细胞迁移作用,最高可达68.89%。综上所述,本研究首先证实了桑葚多糖及其衍生物是通过调节Kupffer细胞免疫活性来发挥其抗化学性肝损伤的治疗作用,为其作为治疗化学性肝损伤潜在药物提供了重要科学依据和数据支撑。其次,对桑葚多糖及其衍生物抗肿瘤活性进行了初步筛选,确认了桑葚多糖抗肿瘤活性部位,为桑葚多糖抗肿瘤活性的新应用及其深度开发与利用提供科学依据及数据支撑。