前言瘢痕疙瘩的防治一直是烧伤整形外科的一大难题,它不仅给人们带来身体残疾、功能障碍和美观尚失,而且造成极大精神创伤。随着人民生活水平的不断提高,对美的需求也日趋强烈,解决瘢痕疙瘩防治的问题已刻不容缓。但瘢痕疙瘩病因和发病机制至今尚不清楚,治疗方法也有限,并且疗效不确切。所以其形成机制和防治方法的研究成为近年的关注焦点,基础研究已进入基因及其蛋白产物和信号传导通路水平,新药的研制也紧落密布地进行。青蒿素是我国有自主知识产权的药物,我国正对该药进行大力开发和研究。青蒿素及衍生物具有很好的抗疟性,但其药理学作用远不只此。近年发现青蒿素有较好的抑制瘢痕成纤维细胞增殖作用,但作用机制方面的研究国内外尚未见到相关报道。本课题旨在通过对二氢青蒿素干预后瘢痕疙瘩成纤维细胞相关凋亡基因和蛋白产物、生长因子及信号传导分子的研究,以揭示二氢青蒿素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制,为瘢痕疙瘩防治开辟新路,对加大青蒿素的应用开发具有重要的意义。目的观察二氢青蒿素能否促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡以及凋亡通路。观察二氢青蒿素作用后瘢痕疙瘩成纤维细胞中bcl-2、p53、survivin和VEGF基因和蛋白表达水平的变化。以寻找二氢青蒿素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和促进其凋亡的机制所在。方法1.采用免疫组化SP法研究bcl-2、p53、survivin和VEGF在瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织中的表达及差异。2.采用组织块贴壁法进行瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37℃,5%CO2,饱和湿度下培养;描述其生长曲线、分裂指数、形态及波形蛋白表达。3.采用MTT法测定二氢青蒿素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的IC50,采用TUNEL法检测二氢青蒿素作用后瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡情况,同时采用比色法测定caspase-3、8和9在二氢青蒿素作用后的活化情况,以判断二氢青蒿素作用后是否导致瘢痕疙瘩成纤维细胞中的caspase活化,并了解是通过哪条通路促进凋亡。4.采用免疫组化SP法初步了解在二氢青蒿素作用前后瘢痕疙瘩成纤维细胞中bcl-2、p53、survivin和VEGF蛋白表达情况。采用RT-PCR方法了解150μmol/L浓度二氢青蒿素作用12小时后的瘢痕疙瘩成纤维细胞中bcl-2、p53、survivin和VEGF基因表达的变化。采用westen-blot方法了解bcl-2、p53、survivin和VEGF蛋白表达的变化。结果1.在所有14例瘢痕疙瘩组织细胞中bcl-2、p53、survivin和VEGF阳性表达分别是78.6%,71.4%, 57.1%和71.4%。其中p53表达定位于胞核,bcl-2、survivin和VEGF表达定位于胞浆。正常皮肤组织中bcl-2、survivin和VEGF阳性表达分别是14.3%, 21.4%, 14.3%和21.4%两组比较有显著性差异(P<0.05)。2.瘢痕疙瘩成纤维细胞培养成功率43%(6/14);48～65天可传第一代,以后每5～10天可传一代,传代后生长良好;细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。3.二氢青蒿素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的IC50为150μmol/L。通过TUNEL法检测到150μmol/L二氢青蒿素作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞后可以见到明显的凋亡细胞。通过比色法检测到caspase-9和caspase-3活化,而caspase-8没有活化。4. 150μmol/L浓度二氢青蒿素作用12小时后的瘢痕疙瘩成纤维细胞中bcl-2和survivin mRNA分别下调39.8%和58.8%,蛋白表达下调32.2%和40.4%,而p53和VEGF mRNA和蛋白表达无明显改变。结论1. bcl-2、p53、survivin和VEGF在瘢痕疙瘩中的表达提示它们可能参与瘢痕疙瘩的形成,这对后续药物治疗机制研究提供了一定的理论基础。2.组织块贴必法培养出的瘢痕疙瘩成纤维细胞可用作体外实验研究,并为进一步实验提供了物质基础。3.一定浓度的二氢青蒿素能够促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡,并通过活化caspase-9后,再活化caspase-3,而启动凋亡程序。4.二氢青蒿素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和促进其凋亡与bcl-2和survivin下调有关。