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1研究背景与目的目前主要观点认为原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发生发展是环境因素和遗传因素双重作用的结局。其发展过程也是一种多因素协同作用和多步骤的过程,在众多环境因素中如,HBV（Hepatitis B virus）感染、HCV（Hepatitis C virus）感染、含有黄曲霉素B1食物污染、水污染和酗酒等都是明显提高HCC发病率的重要因素。从遗传因素方面来说,肝癌是一种遗传物质发生改变的疾病。一些病因如HBV/HCV感染、黄曲霉素B1食物污染和酒精等损害了正常肝细胞基因组,使其形成一种不可逆的损伤,从而引起抑癌基因失活或者原癌基因的活化,导致正常肝脏细胞的增殖、分化和凋亡的规律发生异常改变从而导致肿瘤的发生和发展。肝癌自发性破裂出血（Ruptured HCC,RHCC）是肝脏恶性肿瘤发生发展过程中引起的另一种最严重且致命的症状之一。若不能对该并发症进行正确及时地治疗,患者在发生破裂出血的一个月内病死率可高达25%以上。仅控制肝脏肿瘤的破裂出血并不是对肝癌患者治疗的最终目的,临床上的最终治疗目的是最大限度地延长肝癌患者的生存时间。近年来,随着基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的发展,对肿瘤系统生物学的研究也渐渐地发展起来。在肿瘤系统生物学理论的指导下将基因表达与翻译,结构与功能蛋白质的表达和相互作用,后期各种产物的代谢途径等有关信息进行充分整合,为肿瘤疾病提供了不同种类、不同层次的生命组学数据,进一步理解肿瘤的发生和发展机制。本研究中,从RHCC患者的临床特点以及肿瘤的病理学特征到肝癌破裂患者的遗传易感性和基因表达谱的多层次研究,以提高对RHCC的全面认识,为未来对于RHCC的早期预防、RHCC高危人群的筛查诊断和RHCC治疗方案的设计以及发生肝癌破裂出血的患者预后生存改善提供一定的理论支持。2材料与方法2.1研究对象研究对象来源于2002年至2020年期间就诊于我院诊断为原发性肝细胞肝癌的1543例患者,其中出现肝癌自发性破裂出血的患者186例,定义为破裂组（RHCC）。未出现原发性肝癌破裂的患者1357例,定义为非破裂组（Non-ruptured HCC,NHCC）。2.2研究方法2.2.1临床资料研究临床病例资料中的一般资料、实验室检查指标、病理资料包括:患者年龄、性别、肝硬化、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、血红蛋白（Hemoglobin,HGB）、白细胞（white blood cell,WBC）、血小板（Platelets,PLT）、肌酐（Creatinine,Cre）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、白蛋白（Albumin,ALB）、天门冬氨酸氨基转酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）、凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）、凝血酶原国际标准化比值（International Normalizd ratio,INR）、乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBs Ag）、丙肝抗体（Hepatitis C virus antibody,HCVAb）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、肿瘤最大直径、肿瘤单发和多发等。再通过临床病例资料中的病案首页所记录的联系方式联系患者及其亲属以获取随访信息。单因素分析两组患者的临床影响因素,多因素Logistic回归模型探讨影响肝癌自发性破裂发生的独立危险因素,Cox回归模型进行生存分析。2.2.2全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies,GWAS）主要步骤如下:采用DNA提取试剂盒提取肝脏肿瘤组织DNA,质检合格后,建立DNA文库,进行文库质检后采用二代测序平台进行上机测序。采用标准化流程比对分析数据,最终筛选出与肝癌自发性破裂相关的高频突变基因和突变类型。2.2.3转录组学测序转录组（Transcriptome）测序主要步骤如下:采用RNA提取试剂盒提取肝脏肿瘤组织以及癌旁正常肝脏组织的RNA,并进行质检后,用分光光度计（OD260/280≥1.9）检测RNA浓度和纯度。将m RNA片段化处理后反转录成双链c DNA后扩增构建测序文库。对构建好的文库进行PCR扩增,产生DNA簇,将DNA扩增子线性化成为单链,完成DNA成簇（Cluster）扩增,经过高通量测序得到fastq数据后进行转录组数据分析。2.2.4统计学方法Excel 2007建立数据库,利用SPSS 23.0进行统计分析。采用两独立样本t检验、卡方检验或Fisher确切概率法、Wilcoxon秩和检验。应用多因素Logistic回归模型以确定导致肝癌自发性破裂的独立危险因素。为了比较两组的总生存期（Overall survival,OS）和无病生存期（recurrence-free survival,RFS）的差异,采用Log-rank方法,并通过Graph Pad Prism 8.2.1软件绘制Kaplan-Meier曲线,生存分析使用Cox回归模型。双侧检验显著性水平为P值小于0.05被认为差异有统计学意义。3结果3.1肝癌患者的临床资料回顾性分析3.1.1临床指标的单因素分析RHCC患者中,其血浆ALB及HGB值均明显低于NHCC患者,而WBC、PLT、TBIL、AST、ALT、PT及INR值均明显高于NHCC患者。3.1.2多因素Logistic回归分析多因素Logistic回归模型分析结果显示,影响原发性肝癌自发性破裂的因素主要有性别、高血压、肿瘤最大直径、WBC、ALB。3.1.3生存分析和多因素Cox分析RHCC组患者经过手术治疗后1年、2年、3年OS分别为75.7%、54.2%、35.6%。NHCC组患者1年、2年、3年OS分别为:85.3%、76.5%、67.6%。两组患者OS差异具有统计学意义。RHCC组患者经过手术治疗1年、2年、3年RFS分别为:70.7%、47.6%、23.8%。NHCC组患者1年、2年、3年RFS分别为:74.5%、57.1%、42.7%。两组患者RFS差异具有统计学意义。Cox比例风险模型进行多因素分析显示破裂、PLT、ALB、AST的P值均小于0.05,不同因素的肝癌病例之间生存风险差异具有统计学意义。3.2全基因组关联研究结果通过对123例RHCC组样本和1052例NHCC组对照样本的（Single nucleotide polymorphism,SNP）分型数据进行全基因组关联分析,确认了1个与肝癌自发性破裂显著性关联的易感位点/基因（17q25.3/TBC1D16）。TBC1D16主要体现在可能参与膜蛋白的转运和免疫复合物（Immune complex,IC）吞噬入巨噬细胞胞浆中进行降解的过程中,导致巨噬细胞与IC结合效率进一步受损。引起IC在小血管壁的沉积,机体通过局部炎症反应而使血管受损使肿瘤发生自发性破裂出血。通过应用大样本量的MHC深度测序数据库作为Reference Pannel对GWAS数据进行Imputation分析,发现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）遗传变异可能与肝癌自发性破裂有关。3.3转录组学测序结果通过对15例肝癌自发性破裂和18例非破裂肝癌对照样本进行转录组测序,发现差异基因富集于肿瘤代谢与免疫调控等生物学过程或通路,且基因组学中易感基因TBC1D16表达谱的上调可能与巨噬细胞功能受损有关。4结论（1）肝癌患者临床资料分析结果发现,RHCC组患者的ALB、HGB水平明显低于NHCC组。RHCC组患者的WBC、PLT、TBIL、AST、ALT、PT、INR水平明显高于NHCC组。（2）影响原发性肝癌自发性破裂的因素主要有性别、高血压、肿瘤最大直径、WBC、ALB。（3）破裂、PLT、ALB、AST是影响肝癌患者生存风险的重要因素。（4）TBC1D16（17q25.3）系肝癌破裂易感基因,该基因的突变可能导致巨噬细胞与IC结合效率进一步受损,与肝脏肿瘤自发性破裂的发生有关。（5）发现HLA遗传变异可能与肝癌自发性破裂有关。（6）转录组测序结果提示易感基因TBC1D16表达谱上调。其可能与巨噬细胞吞噬功能受损有关。