集胞藻铁通透酶FTR1的鉴定及功能研究

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铁是生物必需的矿质元素,在光合作用、呼吸作用以及固氮作用中扮演重要角色。尽管地壳中铁含量非常丰富,但是大多数铁都是以沉淀的形式存在,真正能被生物可利用的铁浓度很低。蓝藻是重要的全球初级生产者,常处于缺铁环境中。作为光合生物,蓝藻需要更多的铁(是大肠杆菌的10倍左右)来满足自身的生长需求,它们在长期的进化过程中形成了高效的铁吸收机制。蓝藻质膜上拥有多个铁转运蛋白行使铁的转运吸收功能,这对其铁的吸收和转运是非常有利的。集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803是一种单细胞蓝藻,可以利用葡萄糖进行异养生长,具有天然的外源DNA转化系统,是蓝藻分子遗传学研究的模式生物,目前关于其具体的铁吸收机制还不是很清楚。本研究鉴定了一个新的铁转运蛋白Slr0964,它具有铁通透酶FTR1的相似特征,定位于集胞藻PCC6803的质膜上,在铁吸收转运过程中起到重要的作用。此外,本研究还对集胞藻PCC6803其它铁相关转运蛋白进行了功能研究。  主要研究内容和结果如下:  1、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803铁转运蛋白Slr0964的功能研究。  结果表明:在缺铁情况下,slr0964-Mut突变株的生长速率、叶绿素含量与野生型(WT6803)相比产生了严重的下降。在转录水平上,RT-PCR以及qRT-PCR均证明slr0964基因在缺铁条件下发生了明显的上调表达。进一步通过slr0964基因的互补和超表达实验证明,互补株能够恢复由slr0964基因缺失引起的缺铁表型,slr0964超表达株在缺铁条件下的生长速率比WT6803更高;而铁的毒害实验表明slr0964-OE超表达株的生长速率比WT6803下降地更为明显,这些结果表明slr0964基因很可能参与集胞藻PCC6803铁吸收转运过程。铁含量和同位素55Fe吸收速率进一步发现slr0964-Mut突变株与WT6803相比发生了明显的下降。通过同源序列比对发现Slr0964是一个铁通透酶FTR1类似蛋白,具有多个跨膜结构域。利用水双相法和蔗糖密度梯度离心法证明Slr0964蛋白定位于集胞藻PCC6803的细胞质膜上。进一步用已鉴定的酵母铁通透酶FTR1和大肠杆菌铁通透酶EfeU去互补slr0964-Mut突变株,发现二者均能有效互补由slr0964基因缺失引起的缺铁表型,从而在遗传学水平上证明slr0964基因的编码产物具有铁通透酶功能。此外,Slr0964可能具有专一性的铁吸收作用,研究表明slr0964-Mut突变株并不影响细胞对Zn2+和Mn2+的吸收转运。  2、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803铁通透酶FRT1和其它铁相关转运蛋白对铁吸收转运的贡献及相互作用关系研究。  现已知集胞藻PCC6803质膜上,除了Slr0964(FTR1)之外还拥有另外三个铁转运蛋白Slr0327(FutB)、Slr1392(FeoB)和Sll1263(CDF),此外周质空间蛋白Slr0513(FutA2)和Slr1295(FutA1)也参与铁的吸收转运。本研究利用同源重组的方法,分别对这些铁相关基因进行组合敲除,分别获得了不同的组合敲除突变株或者敲降株。不同组合突变株的铁生长速率和铁含量实验表明,铁转运蛋白Slr0327(FutB)在集胞藻PCC6803质膜上行使着至关重要的作用,而铁通透酶蛋白Slr0964在集胞藻PCC6803质膜起着重要的补充作用。铁含量结果表明Slr0964蛋白基因与其它铁相关基因组合敲除后,其胞内的铁含量下降的非常明显。此外,周质空间蛋白Slr0513(FutA2)基因的缺失表现出对高铁胁迫的耐受性,说明其在协助铁从周质空间转运到细胞质内方面具有重要的作用。
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