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鸡球虫病是由一种或几种鸡艾美球虫寄生于鸡的肠上皮细胞,引起的以肠道病变为主的细胞内寄生虫病,给养禽业带来了巨大的经济损失。目前抗球虫主要依靠药物预防,针对耐药性的产生,迫切需要抗球虫新药的研发。本研究通过人工接种鸡E. tenella孢子化卵囊,分别建立感染组(接种卵囊+正常饲料)和地克珠利组(接种卵囊+ 1 mg/kg地克珠利饲料)球虫感染模型,地克珠利添加时间为接种后第96 h到120 h。以E. tenella第二代裂殖子为研究对象,采用透射电镜观察地克珠利对E. tenella第二代裂殖子超微结构的影响;采用流式细胞术(FCM)测定E. tenella第二代裂殖子凋亡率及线粒体膜电位,在细胞水平上研究地克珠利对E. tenella第二代裂殖子超微结构损伤的机制;采取抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术,从转录基因组水平研究地克珠利抗E. tenella第二代裂殖子作用机理。最终为阐明地克珠利抗鸡E. tenella作用机制及新型抗球虫药物的靶点的筛选提供理论依据。结果如下:1动物模型的建立及E. tenella第二代裂殖子的提取本试验以罗曼优质黄羽蛋公雏口服感染E. tenella孢子化卵囊,复制E. tenella正常感染和地克珠利作用动物模型。在接种后第120 h,通过酶消化、离心沉淀、红细胞裂解和Percoll密度梯度离心等方法的联合应用提取获得纯净的E. tenella第二代裂殖子,扫描电镜观察鉴定获得大量纯净的第二代裂殖子。2地克珠利对E. tenella第二代裂殖子超微结构的影响地克珠利对E. tenella第二代裂殖子超微结构产生了明显的损伤。在透射电镜下,感染组E. tenella第二代裂殖子细胞核双层核膜结构完整,染色质均匀,附着在核膜内侧面,胞质内线粒体丰富。地克珠利组E. tenella第二代裂殖子细胞核染色质明显减少、发生异染色质化,凝集成大的黑色团块、与核膜分离并发生趋边化,线粒体脊模糊、断裂,胞质中出现了大量的空泡,出现了类似于多细胞生物的凋亡现象。3地克珠利对E. tenella第二代裂殖子线粒体膜电位和凋亡率的影响地克珠利对E. tenella第二代裂殖子的线粒体膜电位和凋亡率产生了显著影响。与感染组相比,地克珠利组正常膜电位线粒体的数量降低了97.58% (P < 0.01),散失膜电位线粒体的数量提高了45.04 %( P < 0.01),坏死线粒体的数量提高了266.67% (P < 0.01)。E. tenella第二代裂殖子的早期凋亡率提高了180.75% (P < 0.01),晚期凋亡率提高了86.82% (P < 0.05),与E. tenella第二代裂殖子膜电位的变化呈正相关。以地克珠利组E. tenella第二代裂殖子为实验组,感染组第二代裂殖子为驱动组,构建了消减cDNA文库(T1-H);以感染组第二代裂殖子为实验组,地克珠利组第二代裂殖子为驱动组,构建了消减cDNA文库(T2-H)。经PCR鉴定,文库的重组率都为98%,插入片段都在500bp左右。结合具有高通量筛选能力的cDAN微阵列技术,对差异克隆进行了杂交鉴定。cDNA微阵列杂交分析后共获得881个差异表达基因克隆,其中从T1-H cDNA文库中获得532个,T2-H cDNA文库中获得268个。实时荧光定量PCR验证芯片杂交结果表明与芯片筛选克隆差异上下调趋势相同,程度相似,证明芯片数据可靠。选择251个差异表达基因克隆进行测序,结果获得了229条有效的ESTs序列,采用DNAStar软件进行拼接,最终的拼接序列共计23条Contigs,涉及到182条ESTs序列,32条Singletons序列。Blast X同源性比较分析发现差异基因编码蛋白同源蛋白主要包括:E. tenella微线蛋白、E. tenella表面抗原、E. tenella肌动蛋白解聚因子、E. acervulina热激蛋白90,T. gondii激活蛋白激酶C受体、T. annulata甘油醛-3-磷酸脱氢酶等。这些蛋白参与虫体和宿主细胞间的识别、黏附、入侵以及寄生虫的代谢、信号传导等过程。本研究鉴定获得的差异表达基因为探讨地克珠利的抗球虫分子作用机理的研究奠定的理论基础。5荧光定量PCR检测差异表达基因荧光定量PCR测定表明地克珠利降低了E. tenella第二代裂殖子EtMIC1的65.63% (P < 0.01)、EtMIC2的64.12% (P < 0.01)、EtMIC3的56.82% (P < 0.05)、EtMIC4的73.48% (P < 0.01)、EtMIC5的78.17% (P < 0.05)以及ADF的63.86%(P < 0.01)的mRNA表达量,提示地克珠利可能是通过抑制裂殖子入侵相关基因的表达,抑制入侵复合体的组装,进而干扰虫体入侵宿主细胞,同时药物处理后E. tenella第二代裂殖子的数量的显著降低及感染鸡盲肠病理组织结构的改善也进一步支持我们的推论。6差异基因全长cDNA的克隆、表达和分析根据筛选获得差异表达基因的ESTs序列,利用RACE技术扩增了EtRACK基因的全长cDNA,利用电子克隆的方法扩增了G3PDH基因的全长cDNA。构建了pET-28a-mz-ADF和pET-28a-mz-EtRACK表达质粒,并在E. coli BL21(DE3)中成功诱导表达,采用镍亲和层析法对融合蛋白进行了纯化,制备得到相应的抗体,这将为后续进行球虫发育阶段性表达检测、蛋白表达的定位、蛋白蛋白相互作用及蛋白生物学功能的研究奠定了基础。综上结论,地克珠利对E. tenella第二代裂殖子产生了显著的影响,可能通过以下途径发挥抗E. tenella第二代裂殖子的作用,从而影响虫体的正常发育:(1)降低虫体细胞线粒体膜电位和诱导虫体细胞凋亡;(2)影响虫体骨架相关蛋白的形成,从而使虫体散失生命能力;(3)抑制虫体与宿主细胞间的正常识别;(4)抑制虫体入侵宿主细胞的马达复合物的组装和形成;(5)抑制虫体的信号传导。有关地克珠利抗球虫的分子作用机制还需要进一步的研究和验证。