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研究背景:
顺铂(cisplatin,CDDP)是临床常用的抗肿瘤药,属细胞周期非特异性药物。它通过被动转运以非电荷形式通过细胞膜,进入细胞后氯离子被水分子取代,呈阳性电荷,然后与DNA上的碱基结合,形成链间和链内交联,破坏DNA的功能。如果这种损伤未能修复,将导致细胞生长停滞在G2期并出现凋亡及死亡。
顺铂对睾丸癌、卵巢癌、肺癌和头颈部癌等实体瘤都有很好的疗效,是多种肿瘤化疗方案中的组成药物。但是,肿瘤对顺铂产生耐药性(内在性或获得性),影响了顺铂的临床疗效;至今为止,顺铂耐药性产生的机理仍未阐明。阐明肿瘤对顺铂产生耐药性的机理,对于减少耐药、提高顺铂的疗效、扩大顺铂临床应用范围具有重要的指导意义。
细胞缝隙连接(gapjunction,GJ)是细胞之间的一种蛋白质连接通道,广泛存在于实质性脏器(如心脏,肝脏,肾脏,中枢神经,皮肤,肌肉等)组织中。GJ提供了一种细胞与细胞之间的直接联系通道,是细胞之间信号传递的一种重要方式。GJ异常与许多疾病(包括肿瘤)的发生、发展有密切的关系。在多数肿瘤的形成过程中,常伴随GJ功能降低或消失。恢复肿瘤细胞的GJ,可抑制肿瘤细胞的生长、分化,有利于重建正常的细胞生长调控机制。因此,GJ是一种公认的肿瘤抑制因素。最近的研究证明:在培养的正常细胞和肿瘤细胞,GJ能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用。我们和其它研究发现:顺铂的细胞毒性在GJ存在的情况下显著增强。
GJ影响顺铂等抗肿瘤药物细胞毒性的机理不明。顺铂等抗肿瘤药物的细胞毒性在有GJ存在的情况下增强这一事实表明,顺铂等在引起细胞凋亡(或坏死)的同时,诱导细胞产生了某种可以通过GJ传递的“死亡信号”;这种“死亡信号”通过GJ传递到毗邻的细胞,引起其它细胞死亡或加强顺铂的细胞毒性,这种现象称为“旁细胞效应”。我们推测,当GJ功能降低时,顺铂诱导产生的“死亡信号”不能通过GJ扩散到毗邻的细胞;这种“旁细胞效应”减弱或消失将会导致顺铂的细胞毒性降低。根据此推测和肿瘤组织常伴有GJ功能降低或消失的事实,我们假设:肿瘤细胞GJ功能减退导致顺铂细胞毒性降低,这可能是顺铂耐药性产生的机理之一。
为了证明这一假设,本研究拟在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞上,用多种方法改变GJ功能,通过观察GJ功能改变对顺铂细胞毒性的影响,深入探讨GJ与顺铂细胞毒性的关系。
研究方法:
在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLA细胞,用“标准细胞集落形成分析法”(standardcolony-formingassay)和SRB(sulforhodamineB)法测定顺铂对细胞生长的抑制作用(细胞毒性)。
用不同密度接种细胞的方法,获得生长融合细胞(有条件形成GJ)与生长未融合细胞(无形成GJ的条件)。在上述不同密度接种的细胞,观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。
用“细胞接种荧光示踪法”(ParachuteAssay)测定培养细胞间的GJ功能;并观察目前常用的能影响GJ药物oleamide,18-α-GA和RA对由Cx26/Cx32组成的GJ功能的影响。
用doxycycline控制Cormexin表达,以及用上述药物改变GJ功能对顺铂细胞毒性的影响。
实验结果:
1、不同细胞生长密度对顺铂细胞毒性的影响
细胞集落形成实验结果显示:在生长融合和生长未融合的细胞,5μM顺铂作用1小时后,都能够显著地降低细胞集落形成率。在生长融合细胞(细胞之间形成紧密接触,有条件形成GJ),顺铂对细胞集落生长的抑制率明显高于生长未融合细胞(细胞之间未形成接触,无形成GJ的条件)。SRB结果显示,在1×103~4×104/ml的范围内,随着细胞密度的增加,5μM顺铂作用24小时后顺铂细胞毒性逐渐增强。结果表明,细胞密度增加可显著增强顺铂的细胞毒性。
2、改变Connexin表达对顺铂细胞毒性的影响
细胞接种荧光示踪实验显示,在一定范围内(0.01-1μg/ml),随着doxycycline浓度的增加,细胞通过GJ的荧光传递功能逐渐增强。结果证明,增加doxycycline的浓度,不仅可以增加Cx的表达,而且能够增加GJ形成和功能。集落形成实验结果显示,在一定范围内(0.01—1μg/ml),随着doxycycline浓度的升高,顺铂对细胞集落形成的抑制率逐渐增加。结果证明,顺铂的细胞毒性随GJ功能的增强而增大。
3、抑制GJ功能对顺铂细胞毒性的影响
Oleamide和α-GA是常用的GJ抑制剂,但未见有对由Cx26/Cx32组成的GJ功能影响的报道。细胞接种荧光示踪实验显示,与对照组相比,25μMoleamide组和10μMα-GA组的细胞荧光传递功能显著降低,证明oleamide和18-α-GA能降低由Cx26/Cx32组成的GJ功能。细胞集落形成实验结果显示:在高密度接种细胞(生长融合,有GJ形成),用25αMoleamide和10μM18-α-GA抑制GJ功能,5μM顺铂对细胞集落形成的抑制率明显降低,而在低密度接种细胞(生长未融合,无GJ形成),oleamide,α-GA对顺铂的集落形成抑制率无明显影响。结果表明降低GJ功能可降低顺铂的细胞毒性。
4、增强GJ功能对顺铂细胞毒性的影响
RA是公认GJ增强剂,但未见有对由Cx26/Cx32组成的GJ功能影响的报道。细胞接种荧光示踪实验显示,与对照组相比,10μMRA组的细胞荧光传递功能增强。结果证明,RA显著增强由Cx26/Cx32组成的GJ功能。集落形成实验结果显示:在高密度接种细胞(生长融合,有GJ形成),使用10μMRA增强GJ功能,5αM顺铂对细胞集落形成的抑制率明显增高。而在低密度接种细胞(生长未融合,无GJ形成),RA对顺铂的集落形成抑制率无明显影响。结果表明,增强GJ功能可增加顺铂的细胞毒性。
结论:
1.GJ形成能够增强顺铂的细胞毒性。
2.Oleamide和18-α-GA可通过抑制由Cx26/Cx32组成的GJ功能降低顺铂细胞毒性。
3.RA可通过增强由Cx26/Cx32组成的GJ功能增加顺铂细胞的毒性。